DNA体外扩增技术——聚合酶链式反应(PCR)

PCR(PolymeraseChainReaction)译为聚合酶链式反应 ,是近年来发展起来的一种DNA体外扩增技术 .具有快速 ,简便和特异性强的优点 ,在分子生物学研究方面的应用具有广阔的前景 .本文简要介绍了PCR技术的原理 。

Taq DNA聚合酶的分子改造及其在探针法qPCR直扩体系中的应用

Taq DNA聚合酶作为实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)技术的核心组分,其性能优劣直接影响qPCR技术的进一步发展。然而,野生型Taq DNA聚合酶的耐抑制剂性能差、延伸性能不足。为获得具有高性能的Taq DNA聚合酶,采用基因工程技术将双链DNA结合蛋白Sso7d或Sto7d融合在野生型Taq DNA聚合酶的N端或C端,构建了4个均可溶表达的改造体,再经过耐受性测试筛选较优的改造体,结果显示:改造体Taq-Sto的耐受性最高,其热稳定性不受影响,且在1 s/kbp的延伸条件下能成功扩增靶标,表明Taq-Sto具有增强的延伸性能,在TaqMan探针法qPCR体系中对腐殖酸、单宁酸、全血等抑制剂同样表现出良好的耐受性。EMSA实验发现:Taq-Sto对DNA模板的结合亲和力有所提高,有利于增强Taq-Sto对模板的竞争力;将Taq-Sto应用于非洲猪瘟病毒(ASFV)的TaqMan探针法qPCR检测,与商品化试剂相比,Taq-Sto具有更低的ASFV检出限,且在体积分数为2%~6%的猪粪便样本或猪肉样本中的检测灵敏度分别为100.0%和85.4%,说明Taq-Sto在直扩qPCR检测领域更具有优势。

DNA片段体外扩增技术——聚合酶链式反应(PCR)的原理与应用

随着分子生物学的发展,对特定核甘酸片段进行分离。纯化及扩增已成为基因分子生物学研究的中心问题。过去,人们为了从生物材料中获得某一段特定的DNA(基因)顺序或者进行其顺序分析或鉴定。

PCR(聚合酶链式反应)仪温度特性的实验研究与分析

该文的目的是测量PCR温度的精确性和PCR仪上孔间以及不同循环和不同次测量的温度均一性。PCR程序:95℃(变性),30 s;55℃(退火),40 s;72℃(延伸),50 s;6个循环。孔和管内的温度重复性都很好;变性阶段,孔和管内液体温度与程序温度偏差较大,孔及管内的温度均一性和重复性均很好;孔内温度不能达到通常所需的温度(90℃以上)的比例为22.2%。退火和延伸阶段孔和管内的温差较小;有2个孔不能达到通常需要的温度。实际温度在各阶段停留的时间分别占设定时间的90%的比例较低。这些缺陷可能导致扩增结果假阳性或假阴性。

聚合酶链式反应与DNA探针检测临床标本中结核分支杆菌的评价

本文应用ＰＣＲ联合ＤＮＡ探针快速检测临床标本中结核杆菌ＤＮＡ。对临床３０７例标本同时进行ＰＣＲ和Ｓｏｕｅｈｅｒｎ杂交。其中临床确诊为结核病的１０９例，二者的阳性率分别为４９．６％、６０．６％。未确诊结核病的１９８例，二者均为阳性２例、单纯ＰＣＨ阳性３例。结果表明ＤＮＡ探针检测的灵敏性和特异性高于ＰＣＲ。二者联合使用，有助于对疑难电泳图谱的分析和判断，降低假阴性和假阳性率。

聚合酶链式反应(PCR)荧光检测研究

本文研究了荧光能量传递技术 (fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET) ,建立了一套基于该理论在聚合酶链式反应 (PCR)中用于荧光检测和溯源性研究的实验装置 。

聚合酶链式反应(PCR)用于蚊虫分类鉴定的研究概况

在蚊虫分类中,长期以来都是以形态特征作为分类的依据,然而世界上重要的媒介蚊虫几乎都属于由几个甚至十几个近缘种组成的复合体,它们虽然外部形态相似,但其生态习性、分布区域和媒介效能等却可能有很大差异,所以对其进行正确鉴别具有重要的流行病学意义。然而许多复合体的相继发现,亲缘种的存在,使得单纯的形态分类学无法对其进行正确鉴别。虽然有些学者已经应用遗传杂交、同工酶、多线染色体及气相层析分析昆虫体表碳水化合物组分等方法对近缘种进行了分类研究,但都难以对亲缘种做出可靠鉴定或在流行病学调查中推广应用。 近30年来分子生物学技术迅速发展,显示其在蚊类鉴别应用中的极大潜力,为蚊虫分类学研究提供了许多新思路新方法。其中PCR技术由于原理简单,方法简便,敏感性高,标本材料极省,蚊类虫期、性别不限等优点,被广泛应用于蚊虫近缘种的分类鉴定中。Paskewitz等首先应用PCR技术,对冈比亚按蚊（An.gambiae）和阿拉伯按蚊（An.arbiebsis）进行分类鉴定。Porter和Collins对佛氏按蚊（An.freeborni）和赫氏按蚊（An hermsi）的rD-NA/ITS2区使用PCR法作蚊种鉴别,其他一些国内外学者在此方面也进行了一些研究,本文就该领域的研究现状及PCR技术应用于蚊虫分类的特点进行简要的概述。

常用聚合酶链式反应(PCR)技术概述

聚合酶链式反应（PCR）技术在过去20多年中，经过不断改良以及与其他研究手段相结合，如今已发展为有数十种之多研究方法的一套技术手段。本文对较常用的几种PCR技术手段的原理、优点、缺点和应用等作了概述。

聚合酶链式反应(PCR)技术在临床检验中的应用

聚合酶链式反应是近年来发展起来的体外基因扩增技术,已经在很短的时间里迅速进入生命科学、医学研究、遗传工程、疾病诊断、法医学、考古学等各个领域。本文简要介绍这种技术在临床检验中的应用。

聚合酶链式反应(PCR)技术在植物病害诊断中的应用

PCR技术是一项崭新的体外扩增基因的技术 ,已广泛应用于与生命相关的学科的研究。本文从植物病害检测的角度 ,探讨如何应用PCR技术来进行植物病害的检测。

实时荧光聚合酶链式反应技术在慢性乙型肝炎患者血清标本HBV DNA定量检测中的应用价值

目的探讨实时荧光聚合酶链式反应(FQ-PCR)技术在慢性乙型肝炎(CHB)患者血清标本HBV DNA定量检测中的应用价值。方法选取2015年4月至2018年6月南阳市第二人民医院收治的109例CHB患者作为研究组,同期81例HBV早期感染者作为对照组。均以FQ-PCR技术检测血清标本HBV DNA水平,同时研究组接受拉米夫定治疗,采用FQ-PCR技术动态监测血清标本HBV DNA变异情况,对比两组入院首次HBV DNA表达水平及研究组治疗前后HBV DNA表达水平和变异率。结果入院首次检测研究组HBV DNA表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。经单因素方差分析,治疗后3、6、9个月HBV DNA表达水平对比,差异有统计学意义(P<0.05);两两对比,治疗后9、6个月HBV DNA表达水平低于治疗后3个月,治疗后3个月低于治疗前,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后9个月HBV DNA变异率高于治疗后6个月,治疗后6个月高于治疗后3个月、治疗前,差异有统计学意义(P<0.05)。结论实时FQ-PCR技术检测血清标本HBV DNA水平可客观反映HBV感染、复制活性,可为临床诊断、疗效评估提供数据支持。

肺炎支原体快速聚合酶链式反应（PCR）法检测

本文根据Ｂｅｒｎｅｉ设计的肺炎支原体ＰＣＲ引物，采用国产的耐热ＤＮＡ聚合酶，建立了双温循环肺炎支原体ＰＣＲ快速检测法。４０例儿童肺炎咽拭子标本中，８例呈阳性结果。

聚合酶链反应(PCR)检测水中钩体DNA方法的建立和初步应用

目的:为了建立一个检测水中钩体DNA的技术方法。方法:本研究采用了根据1993年C.Gravekamp设计的引物G_1G_2序列自行合成的引物G_1G_2建立了检测致病钩体DNA的PCR方法。运用此方法并结合“优筛法”对采自云南河口、蒙自等地区108份水样进行检测,并与分离培养后经中国药品生物制品检定所鉴定结果进行了比较。结果:两组方法检测所有水样呈阴性,其精确度和一致性达100％,但分离培养方法漏检率为8.3％(9/108)。结论:建立了PCR检测水中钩体DNA方法。此方法简单、快速、准确,适用于一般实验室及大规模水样钩体DNA的检测,值得推广应用。

M1磁珠富集联合重组酶介导的聚合酶链式反应技术检测肺炎克雷伯菌

一直以来,人类健康都在承受着病原微生不同程度的威胁,其中肺炎克雷伯菌是常见的条件致病菌之一,当机体免疫力低下时,容易发生炎性病变,从而引起肺炎、尿路感染和败血症等院内感染。综合分析肺炎克雷伯菌的致病特征,认为快速、准确地从患者血液中检出病原菌,对感染患者进行及时的治疗具有重要意义。方法 传统病原微生物的检测有培养法、免疫检测或者生化鉴定等方法,随着分子生物学技术不断发展,使病原微生物的快速和灵敏检测成为了可能,结合我们新型的聚合酶链式反应技术,产生新的实验方法,探讨分析M1磁珠富集联合重组酶介导的聚合酶链式反应技术检测的可行性以及临床样本中病原菌核酸的最优提取方法。结果 在已经建立的PCR方法中的引物作为内引物的基础上,根据RAA的引物设计原则设计RAA反应过程的外引物,筛选出最优引物对,建立RAP的方法和检测技术,预期核酸扩增特异性达到100%,检测下限达到10CFU/mL。结论 分析肺炎克雷伯菌的病原学特征、基因的特点,建立了这套灵敏度高、特异性强、反应迅速可靠的M1磁珠富集联合重组酶介导的聚合酶链式反应技术,使得检测血液样本中的肺炎克雷伯菌更具特异性,有助于发现早期细菌感染患者并给予其及时的治疗,为今后肺炎克雷伯菌的准确诊断提供了新的选择。

提高SAF基因启动子区DNA模板聚合酶链式反应的扩增效率

背景:血清淀粉样蛋白A转录激活因子基因启动子区鸟嘌呤和胞嘧啶的含量偏高,常规聚合酶链式反应扩增不易成功。目的:探索提高血清淀粉样蛋白A转录激活因子基因启动子区富含鸟嘌呤和胞嘧啶的DNA模板聚合酶链式反应扩增方案及优化的扩增体系。方法:提取THP-1细胞基因组DNA作为模板,通过97℃高温预变性及最佳退火温度的探索优化聚合酶链式反应的反应条件,在聚合酶链式反应扩增体系中添加不同浓度的增强剂二甲基亚砜改善反应体系。建立提高血清淀粉样蛋白A转录激活因子基因富含鸟嘌呤和胞嘧啶的启动子区聚合酶链式反应扩增效率的方法,同时评估不同浓度二甲基亚砜对聚合酶链式反应扩增结果的影响。结果与结论:97℃高温预变性使模板DNA充分解链,同时提高退火温度至60℃,有利于提高聚合酶链式反应扩增产率;反应体系中添加2%二甲基亚砜可以提高血清淀粉样蛋白A转录激活因子基因启动子区聚合酶链式反应产物的特异性和产率,但是鸟嘌呤和胞嘧啶含量不同对增强剂的依赖不一样。结果证实,高温预变性和较高的退火温度可以保证充分解链的模板DNA与引物特异性结合,但是DNA模板鸟嘌呤和胞嘧啶含量的不同对增强剂二甲基亚砜的依赖有差异。

用聚合酶链反应（PCR）技术检测尖锐湿疣组织中人乳头瘤病毒DNA

用聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）技术对４０例女性下生殖道尖锐湿疣组织中人乳头瘤病毒（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ）６Ｂ／１１ＤＮＡ进行了检测，其中３３例阳性（８２．５％）。结果表明，ＰＣＲ技术是当前检测尖锐湿疣中ＨＰＶ感染快速、特异、灵敏的检测方法。

DNA体外扩增技术的突破——聚合酶链反应(PCR)的发展与应用

过去,人们为了从生物材料中获得某一段特定的DNA(基因)顺序或者进行其顺序分析或鉴定,需要经过非常繁琐的步骤并耗费大量的时间,而且往往还会由于所从事样品的复杂性、不均一性或含量太少而无法达到目的。最近由美国Cetus公司人类遗传部的一个小组研究和发展起来的聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)

聚合酶链式反应(PCR)技术鉴定啤酒腐败菌的最新进展

综述了PCR技术在啤酒腐败细菌鉴定方面的应用及最新进展 ;介绍了 3种PCR技术 ,特别讲述了利用这些技术对啤酒中乳酸菌的鉴定 ;并分析了PCR技术的局限性 ,对其应用前景进行了展望。

Pfu-sso7d DNA聚合酶的制备及反应缓冲液的研究

目的:制备有高效扩增长片段以及复杂片段能力的Pfu DNA聚合酶。方法:运用基因工程学方法构建重组质粒pET-28a-Pfu-sso7d,采用优化后的诱导条件对pET-28a-Pfu-sso7d实行诱导表达,将菌液超声破碎并提取上清液,应用镍亲和层析洗脱纯化取得较纯Pfu-sso7d DNA聚合酶。采用qPCR方法对酶进行酶活力单位定量、确定反应缓冲液组分最佳浓度及检测自制Pfu-sso7d DNA聚合酶酶活性。结果:在1 mmol·L^(-1) IPTG、16℃条件下诱导Pfu-sso7d DNA聚合酶菌液16 h,Pfu-sso7d DNA聚合酶高效表达;用20~100 mmol·L^(-1)咪唑可将蛋白洗脱。Pfu-sso7d DNA聚合酶最终活力单位定量为1 U·μL^(-1)。PCR最佳反应缓冲液为pH9.0、20 mmol·L^(-1) Tris-HCl、0.6 mmol·L^(-1) MgSO_(4)、50 mmol·L^(-1) KCl、5 mmol·L^(-1)(NH_(4))_(2)SO_(4)、0.1%Triton X-100,添加剂组分为3%DMSO、1 mol·L^(-1)甜菜碱。Pfu-sso7d DNA聚合酶能高效扩增3000 bp的目的条带,活性达到商用高保真DNA聚合酶水平。结论:基于基因重组制备的Pfu-sso7d DNA聚合酶可进行高效的PCR反应,节省了实验室PCR成本,为进一步提高Pfu DNA聚合酶活性提供一定技术参考。

超嗜热古菌Palaeococcus pacificus PolB DNA聚合酶和dUTPase在PCR反应中的应用

为了获取具有广泛适用性的DNA聚合酶,将深海热液区获得的超嗜热古菌Palaeococcus pacificus DY20341的Pol B DNA聚合酶和d UTPase进行原核表达和纯化,将得到的Pol B DNA聚合酶及d UTPase混合后用于扩增古菌、细菌和真核生物的基因.通过PCR反应成功地扩增了商业化Pfu DNA聚合酶所不能扩增的Palaeococcus pacificus DY2034的琼脂酶基因.由此可知,尽管商业化的DNA聚合酶多种多样,针对不同扩增目的片段所需的特异DNA聚合酶体系仍然是必要的,这是又一嗜热古菌B家族DNA聚合酶应用的报道.