Taq DNA聚合酶的分子改造及其在探针法qPCR直扩体系中的应用

Taq DNA聚合酶作为实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)技术的核心组分,其性能优劣直接影响qPCR技术的进一步发展。然而,野生型Taq DNA聚合酶的耐抑制剂性能差、延伸性能不足。为获得具有高性能的Taq DNA聚合酶,采用基因工程技术将双链DNA结合蛋白Sso7d或Sto7d融合在野生型Taq DNA聚合酶的N端或C端,构建了4个均可溶表达的改造体,再经过耐受性测试筛选较优的改造体,结果显示:改造体Taq-Sto的耐受性最高,其热稳定性不受影响,且在1 s/kbp的延伸条件下能成功扩增靶标,表明Taq-Sto具有增强的延伸性能,在TaqMan探针法qPCR体系中对腐殖酸、单宁酸、全血等抑制剂同样表现出良好的耐受性。EMSA实验发现:Taq-Sto对DNA模板的结合亲和力有所提高,有利于增强Taq-Sto对模板的竞争力;将Taq-Sto应用于非洲猪瘟病毒(ASFV)的TaqMan探针法qPCR检测,与商品化试剂相比,Taq-Sto具有更低的ASFV检出限,且在体积分数为2%~6%的猪粪便样本或猪肉样本中的检测灵敏度分别为100.0%和85.4%,说明Taq-Sto在直扩qPCR检测领域更具有优势。

血清中DNA聚合酶α在阿尔茨海默病中的表达和诊断价值分析

目的探究血清中DNA聚合酶α(DNA polα)在阿尔茨海默病(AD)中的表达水平,分析其在AD中的诊断价值。方法选取2019年3月至2023年4月在首都医科大学宣武医院就诊的AD痴呆(DAT)期患者100例作为DAT组,轻度认知障碍(MCI)期患者43例作为MCI组;同期,选取68例同年龄组别的健康者作为HC组。检测各组血清样本中DNA polα的表达水平,利用受试者工作特征(ROC)曲线分析DNA polα在AD中的诊断价值。结果DAT组血清DNA polα表达水平高于MCI组(P<0.05)和HC组(P<0.001),随着AD病程发展,DNA polα表达水平有递增趋势。DNA polα表达水平与简易智能精神状态检查量表(MMSE)和蒙特利尔认知评估量表(MoCA)评分均呈负相关(r=-0.1553、-0.2037,P<0.05)。DNA polα诊断DAT期的曲线下面积(AUC)为0.682,灵敏度为0.900,特异度为0.412;DNA polα诊断MCI期的AUC为0.546,灵敏度为0.977,特异度为0.250;DNA polα鉴别诊断MCI期和DAT期的AUC为0.664,灵敏度为0.780,特异度为0.535。结论DNA polα在DAT期AD患者中表达水平升高,且其表达水平与AD病程发展存在一定联系,推测DNA polα有可能是诊断AD潜在的血液生物标志物。

DNA聚合酶θ:易错的多功能DNA末端修复分子

DNA聚合酶θ(DNA polymerase theta,Polθ)是一种广泛存在于动植物中的DNA修复酶。它在选择性末端连接(alternative end-joining,Alt-EJ)途径中发挥着关键作用,常参与DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSB)损伤修复。在正常生理状态下,Polθ主要调控基因组稳定性。然而,在恶性肿瘤发生时,Polθ表现出异常高表达水平,并参与调控肿瘤细胞的恶性转变过程。研究表明,抑制Polθ活性可导致同源重组(homologous recombination,HR)缺陷的肿瘤细胞发生合成致死(synthetic lethality,SL)。因此,已经开发出多种针对Polθ的小分子抑制剂,可与其他化疗药物联合使用以抑制恶性肿瘤的发展。此外,敲除或抑制Polθ活性还能增加HR修复效率,从而提高外源基因靶向整合效果。本文综述了Polθ及其介导的Alt-EJ修复机制在生物学功能方面的最新研究进展,为靶向Polθ在肿瘤治疗和基因编辑方面的应用提供理论基础。

DNA聚合酶η小分子抑制剂筛选

DNA损伤修复以及基因组稳定性维持对于动植物正常生长和防御逆境至关重要。针对DNA聚合酶错误掺入导致的基因组不稳定性,本研究以DNA聚合酶η为研究对象,通过计算分子模拟对接的方式,对其可能的小分子抑制剂进行筛选,并对其酶动力学参数进行测定。结果显示:脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate,d ATP)对DNA聚合酶η的活性具有抑制效果,使其延伸的相对效率为36%~42%。分子模拟对接和体外实验结果表明,相较于dATP(亲和力为-26.7 kJ/mol),环鸟苷酸-腺苷酸(cyclic GMP-AMP,cGAMP)与DNA聚合酶η具有更低的结合能(亲和力为-35.1 kJ/mol)。酶动力学参数测定结果也表明,相较于dATP,cGAMP具有更强的抑制能力且在浓度为0.5 mmol/L时达到最强(相对延伸效率为13%)。因此,本研究筛选获得了针对DNA聚合酶η的一种潜在的小分子抑制剂。同时,鉴于该蛋白质高表达导致细胞对抗肿瘤药物(DNA损伤剂)的耐受性,这为新型药物的开发提供了依据。

DNA聚合酶θ的合成致死作用研究

利用合成致死(SL)作用治疗癌症可能会成为一种有效且对患者安全的方案。在诱导合成致死效应的众多因素中,参与DNA修复的因素是最密切相关的。当一个经典的DNA双链断裂(DSB)修复途径发生突变时,替代途径可能是消除肿瘤细胞的靶标。目前,抑制缺乏经典修复途径肿瘤细胞中的RAD52和/或PARP1一直是诱导合成致死作用的潜在靶标,但是,常用的PARP1抑制剂(PARPi)的耐药性是制定治疗方案的最大障碍。由POLQ基因编码的DNA聚合酶θ(Polθ)介导的末端连接(TMEJ)在另一种DSB修复途径起关键作用。因此,它是治疗具有同源重组修复(HRR)缺陷肿瘤的潜在靶点,抑制其活性可以诱导SL。在本综述中,主要讨论了基于靶点Polθ合成致死性的抗癌疗法的现状。

常用限制性内切酶和DNA聚合酶的规范编排

一、限制性内切酶限制酶的命名,1973年由Smith和Nathans提出:用属名的头1个字母和种名的头2个字母,组成3个字母的略语,表示寄主菌的物种名称;如有菌株名,再加上一个字母,即第4个字母表示菌株;1种特殊的菌株,具有几个不同的限制与修饰体系,则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。例如:Eco R I,第1个大写字母E为大肠杆菌Escherichia coli的属名的第1个字母;第2、3两个小写字母co为其种名的2个字母;第4个字母大写R表示所用大肠杆菌的菌株编号。再如,流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。例如,从流感嗜血杆菌d株(Haemophilus influenzad d)中先后分离到3种限制酶,则分别命名为Hin d I、Hin dⅡ和Hin dⅢ。

Pfu-sso7d DNA聚合酶的制备及反应缓冲液的研究

目的:制备有高效扩增长片段以及复杂片段能力的Pfu DNA聚合酶。方法:运用基因工程学方法构建重组质粒pET-28a-Pfu-sso7d,采用优化后的诱导条件对pET-28a-Pfu-sso7d实行诱导表达,将菌液超声破碎并提取上清液,应用镍亲和层析洗脱纯化取得较纯Pfu-sso7d DNA聚合酶。采用qPCR方法对酶进行酶活力单位定量、确定反应缓冲液组分最佳浓度及检测自制Pfu-sso7d DNA聚合酶酶活性。结果:在1 mmol·L^(-1) IPTG、16℃条件下诱导Pfu-sso7d DNA聚合酶菌液16 h,Pfu-sso7d DNA聚合酶高效表达;用20~100 mmol·L^(-1)咪唑可将蛋白洗脱。Pfu-sso7d DNA聚合酶最终活力单位定量为1 U·μL^(-1)。PCR最佳反应缓冲液为pH9.0、20 mmol·L^(-1) Tris-HCl、0.6 mmol·L^(-1) MgSO_(4)、50 mmol·L^(-1) KCl、5 mmol·L^(-1)(NH_(4))_(2)SO_(4)、0.1%Triton X-100,添加剂组分为3%DMSO、1 mol·L^(-1)甜菜碱。Pfu-sso7d DNA聚合酶能高效扩增3000 bp的目的条带,活性达到商用高保真DNA聚合酶水平。结论:基于基因重组制备的Pfu-sso7d DNA聚合酶可进行高效的PCR反应,节省了实验室PCR成本,为进一步提高Pfu DNA聚合酶活性提供一定技术参考。

聚ADP-核糖聚合酶-1在喉鳞状细胞癌细胞DNA氧化损伤及凋亡中的作用

目的探究聚ADP-核糖聚合酶-1(PARP1)在喉鳞状细胞癌(LSCC)中的表达及其对LSCC细胞DNA氧化损伤与凋亡的影响。方法收集40例患者的LSCC组织及癌旁组织样本,采用免疫组化染色和qRT-PCR检测LSCC组织与癌旁组织中PARP1的表达。采用不同浓度Menadione诱导LSCC细胞系Hep-2,MTT法检测不同浓度诱导下细胞增殖抑制率。将Hep-2细胞随机分为对照组(正常培养)、Men组(20μmol/L Menadione处理)、Men+PARP1抑制剂组(20μmol/L Menadione+10μmol/L PARP1抑制剂Olaparib共处理)。MTT法计算各组细胞增殖抑制率;流式细胞术检测各组细胞内活性氧(ROS)水平;细胞免疫荧光染色观察各组细胞DNA损伤标记分子γ-H2AX焦点生成情况;Western blot测定各组细胞γ-H2AX、DNA-PKcs、BRCA1、LIG4、Caspase-3及Caspase-9蛋白表达;Hoechst33258染色观察各组细胞凋亡情况。结果LSCC组织中PARP1阳性表达率及PARP1 mRNA表达均明显高于癌旁组织(P<0.01)。Hep-2细胞经不同浓度Menadione诱导后,细胞增殖抑制率均升高(P<0.05)。与对照组比较,Men组和Men+PARP1抑制剂组的细胞增殖抑制率升高,细胞ROS水平升高,γ-H2AX焦点形成明显增加,γ-H2AX蛋白表达上调,DNA-PKcs、BRCA1、LIG4蛋白表达均下调,细胞出现浓缩、碎裂的蓝色凋亡体,Caspase-3和Caspase-9蛋白表达上调,差异均有统计学意义(P<0.05),且Men+PARP1抑制剂组以上变化较Men组更明显(P<0.05)。结论PARP1在LSCC组织中高表达,抑制其表达能够进一步加重Menadione诱导的Hep-2细胞DNA氧化损伤,并促进细胞凋亡。

重组大肠杆菌生产TaqDNA聚合酶发酵工艺优化

Taq DNA聚合酶是PCR技术中广泛应用的耐热酶。为提高重组大肠杆菌生产Taq DNA聚合酶的产量,以Taq DNA聚合酶产量和酶的比活力为考察指标,通过单因素实验优化产生TaqDNA聚合酶含量的单因素:发酵温度、pH值、IPTG诱导剂用量、诱导时间、接种量,结果表明:发酵温度、pH值、IPTG诱导剂浓度,对该基因工程菌发酵产Taq DNA聚合酶的比酶活力有显著影响,而诱导培养时间、接种量对产Taq DNA聚合酶的比酶活力影响不显著。故选择发酵温度、pH值、IPTG诱导剂浓度作为响应面的三个因素优化重组大肠杆菌生产Taq DNA聚合酶发酵工艺,响应面分析结果显示对酶的比活力显著性顺序为:IPTG诱导剂浓度>发酵温度>pH值,最佳发酵工艺参数为:发酵温度37.2℃,pH值为7.5,IPTG诱导剂浓度为0.800 mmol/L,在此条件下发酵,Taq DNA聚合酶比活力达到(43.822±0.878)kU/mg。

重组突变型DNA聚合酶β表达载体pcDNA3.1-polβ的构建

目的 :构建含突变型 polβ基因重组表达载体。 方法 :从食管癌标本中提取总RNA ,反转录合成cDNA ,克隆入 pCDNA3.1质粒。以通用鉴定引物PCR扩增、小量提取质粒酶切鉴定重组质粒 ,并进行测序。 结果 :测序结果证实重组载体中的外源片段序列与所选取的标本完全相符。结论 :成功构建了含突变型polβ基因重组表达载体 ,可应用于下游研究。

卵巢良恶性病变组织中DNA聚合酶β(DNApolβ)和铁蛋白(FT)表达及意义

目的研究卵巢腺癌、浆液性或黏液性囊腺瘤及正常卵巢组织中DNA聚合酶β(DNApolβ)和铁蛋白(FT)的表达水平及其临床病理意义。方法43例卵巢腺癌、15例浆液性囊肿瘤、15例黏液性囊腺瘤和10例正常组织常规制作石蜡包埋切片DNApolβ和FT染色方法为EnVisionTM免疫组化法。结果卵巢腺癌DNApolβ和FT表达阳性率(48.8%,58.1%)明显高于黏液性囊腺瘤(20.0%,26.7%,P<0.05)、浆液性囊腺瘤(20.0%,26.7%,P<0.05)和正常组织(0%,0%,P<0.01);组织学分级G1、临床分期Ⅰ+Ⅱ、无淋巴结转移及未侵犯周围组织器官的腺癌病例DNApolβ表达阳性率明显低于组织学分级G3、临床分期Ⅲ+Ⅳ、淋巴结转移及侵犯周围组织器官病例(P<0.05或P<0.01);组织学分级G1及无淋巴结转移病例FT表达阳性率明显低于组织学分级G3和淋巴结转移病例(P<0.05)。结论DNApolβ和FT表达水平可能是反映卵巢腺癌发生、进展、生物学行为及预后的重要生物学标志物。

DNA聚合酶kappa(POLK)基因rs5744724多态性与缺血性中风气虚证及血瘀证的关联分析

目的分析DNA聚合酶kappa(POLK)基因rs5744724多态性与缺血性中风(IS)中医证候及其数量性状的关联。方法共纳入汉族缺血性中风患者774例,正常对照793例。IS患者中医证候诊断采用《中风病辨证诊断标准》。运用MassARRAY SNP基因分型技术对POLK基因rs5744724多态性进行基因分型检测。使用HITACHI日立7600全自动生化分析仪及StAgO Capact血凝仪测定样本血脂及凝血指标。遗传关联的分析采用PLINK软件进行。结果 POLK基因rs5744724的基因型频率在IS气虚证+IS血瘀证的病例与对照组之间的分布差异有统计学意义(P<0.05)。POLK基因rs5744724多态性与缺血性中风气虚证[显性模型:OR(95%CI)=0.60(0.36-0.99),P=0.044]、血瘀证[加性模型:OR(95%CI)=0.71(0.52-0.97),P=0.029;显性模型:OR(95%CI)=0.68(0.47-0.98),P=0.038;等位模型:OR(95%CI)=0.70(0.51-0.96),P=0.025]发生风险的关联性均有统计学意义;校正性别、年龄后,POLK基因rs5744724多态性与缺血性中风气虚证[显性模型:ORadj(95%CI)=0.59(0.36-0.97),Padj=0.037]、血瘀证[加性模型:ORadj(95%CI)=0.69(0.51-0.94);Padj=0.020;显性模型:ORadj(95%CI)=0.66(0.46-0.95),Padj=0.027]发生风险均显著关联。POLK基因rs5744724多态性与缺血性中风患者收缩压水平的具有统计学关联。结论 POLK基因rs5744724多态性可能影响中国汉族人缺血性中风气虚证及血瘀证的发生。

重组野生型DNA聚合酶β表达载体VR1012-polβ的构建

目的 :构建含有野生型DNA聚合酶 β基因的重组表达载体VR10 12 polβ。 方法 :提取胎儿食管上皮组织的总RNA ,反转录成cDNA ,经PCR扩增、酶切后克隆入表达载体VR10 12 ,重组子以小量质粒提取后酶切、PCR、测序鉴定。结果 :插入片段与GenBank报道一致 ,并且插入方向正确。结论 :重组野生型DNA聚合酶 β表达载体VR10 12 polβ的构建成功 。

HBV DNA聚合酶在介导HBV相关肝细胞癌肿瘤细胞免疫逃逸中的作用

目的本研究旨在明确HBV DNA聚合酶是否与T淋巴细胞功能衰竭相关,进而介导HBV相关肝细胞癌(HCC)肿瘤细胞的免疫逃逸以及探寻具体的分子机制。方法稳定转染带有Flag标签的HBV DNA聚合酶表达质粒(FlagHBV-P)和细胞间黏附分子-1(ICAM1)的肝癌细胞系Huh7、HepG2与Jurkat细胞共培养,MTT、qRT-PCR、酶联免疫吸附测定(ELISA)实验分别检测Jurkat细胞增殖、活化(CD69表达)以及细胞因子IFN-γ分泌情况。RNA-seq筛选稳转细胞系与对照细胞中表达差异的免疫相关分子,mRNA半衰期及蛋白半衰期实验确定HBV DNA聚合酶对免疫相关分子具体在何种水平产生影响。网站预测此免疫相关分子启动子区域可能结合的转录因子,Western Blot实验验证转录因子对免疫相关分子的影响,挽救实验确定HBV DNA聚合酶是否通过此转录因子影响免疫相关分子的表达水平。两组间比较采用成组t检验。结果与对照组相比,实验组细胞(Huh7、HepG2)增殖、活化及细胞因子分泌明显降低(P值均<0.01)。与对照细胞相比,实验组细胞(Huh7、Hep G2)的ICAM1 mRNA和蛋白水平均降低(P值均<0.01)。网站预测ICAM1启动子并初步筛选锚定了NFKB1、RELA和STAT3。与对照组相比,实验组细胞(Huh7、Hep G2)p65蛋白的表达水平明显降低(P值均<0.01)。过表达p65后,ICAM1蛋白表达水平明显升高,降表达p65后,ICAM1蛋白表达水平明显降低(P值均<0.01),挽救实验中过表达p65后,对照组与实验组细胞的ICAM1表达水平无明显差异(P值均>0.05)。过表达ICAM1后,对照组与实验组细胞(Huh7、Hep G2)的增殖、活化及细胞因子分泌无明显差异(P值均>0.05)。结论HBV DNA聚合酶通过抑制NF-κB中p65的表达来下调ICAM1的水平以介导HCC免疫逃逸。

常用限制性内切酶和DNA聚合酶的规范编排

一、限制性内切酶限制酶的命名,1973年由Smith和Nathans提出:用属名的头1个字母和种名的头2个字母,组成3个字母的略语,表示寄主菌的物种名称;如有菌株名,再加上一个字母,即第4个字母表示菌株;1种特殊的菌株,具有几个不同的限制与修饰体系,则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。

常用限制性内切酶和DNA聚合酶的规范编排

一、限制性内切酶限制酶的命名,1973年由Smith和Nathans提出:用属名的头1个字母和种名的头2个字母,组成3个字母的略语,表示寄主菌的物种名称;如有菌株名,再加上一个字母,即第4个字母表示菌株;1种特殊的菌株,具有几个不同的限制与修饰体系,则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。例如:Eco R I,第1个大写字母E为大肠杆菌Escherichia coli的属名的第1个字母;第2、3两个小写字母co为其种名的2个字母;第4个字母大写R表示所用大肠杆菌的菌株编号。再如,流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。例如,从流感嗜血杆菌d株(Haemophilus influenzad d)中先后分离到3种限制酶,则分别命名为Hin d I、Hin dⅡ和Hin dⅢ。

RNA聚合酶动态调控DNA转录的单分子水平研究进展

真核生物的RNA聚合酶Ⅱ(Pol Ⅱ)和原核生物的RNA聚合酶(RNAP)主要负责转录合成信使RNA(mRNA),调控不同基因的转录水平,以调节生物体的生长发育和应对复杂多变的环境。研究者采用传统的荧光显微镜观测到RNAP可形成团簇,据此针对DNA转录调控提出“转录工厂”模型。随着单分子技术的发展,研究者在单分子水平上观测到了活细胞中RNAP动态调控DNA转录,提出RNAP可以通过液-液相分离机制进行转录调控。该综述总结了不同单分子荧光显微镜的技术原理,以及相关的荧光探针标记方法,并介绍了在真核生物和原核生物中应用单分子成像技术可视化RNA聚合酶动态调控DNA转录过程的研究进展,最后展望了单分子技术在转录调控研究中的应用前景。

四种DNA聚合酶扩增效果的比较

目的比较及评价不同品牌的DNA聚合酶的扩增效果,为筛选性价比高的酶提供参考。方法本实验选用四个品牌的DNA聚合酶,设定不同的模板浓度、产物长度、退火温度等进行PCR扩增,扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。结果四个品牌的聚合酶通过灵敏度检测的检测下限都在10 pg/μl以下,退火温度在55~65℃范围都能扩增出目的条带,对退火温度的适应范围比较广。品牌4扩增出的目的条带最多,扩增范围最广;品牌2电泳条带最明亮,扩增能力最强;品牌1条带最单一,扩增特异性最好。结论四个品牌的酶在灵敏度、扩增长度、退火温度范围、扩增时间等方面都有一定差异。品牌2扩增能力最强,性价比最高,更适合工业领域。

实时荧光聚合酶链式反应检验用于乙型肝炎病毒DNA检测的价值分析

目的:探讨实时荧光聚合酶链式反应(PCR)检验用于乙型肝炎病毒(HBV)DNA检测中的价值。方法:选取2020年1月—2023年1月清镇市第一人民医院收治的乙型肝炎患者112例为研究对象,均经标准abbot药盒检测确诊,包括HBsAg(+)、HBcAb(+)、HBeAg(+)(临床习惯称为“大三阳”)62例、HBsAg(+)、HBcAb(+)、HBeAb(+)(临床习惯称为“小三阳”)50例。患者均接受酶联免疫吸附法检验与实时荧光PCR检验HBV-DNA。将标准abbot药盒检测结果作为金标准,评价酶联免疫吸附法检验与实时荧光PCR检验的诊断效能。结果:临床最终诊断结果显示“大三阳”62例(阳性)、“小三阳”50例(阴性),酶联免疫吸附法检出阳性50例、阴性62例,实时荧光PCR检验检出阳性58例、阴性54例;实时荧光PCR检验诊断准确度、特异度、灵敏度高于酶联免疫吸附法检验,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:与酶联免疫吸附法检验比较,HBV-DNA检测中采取实时荧光PCR检验,可提高对“大三阳”与“小三阳”的诊断效能。

超嗜热古菌Palaeococcus pacificus PolB DNA聚合酶和dUTPase在PCR反应中的应用

为了获取具有广泛适用性的DNA聚合酶,将深海热液区获得的超嗜热古菌Palaeococcus pacificus DY20341的Pol B DNA聚合酶和d UTPase进行原核表达和纯化,将得到的Pol B DNA聚合酶及d UTPase混合后用于扩增古菌、细菌和真核生物的基因.通过PCR反应成功地扩增了商业化Pfu DNA聚合酶所不能扩增的Palaeococcus pacificus DY2034的琼脂酶基因.由此可知,尽管商业化的DNA聚合酶多种多样,针对不同扩增目的片段所需的特异DNA聚合酶体系仍然是必要的,这是又一嗜热古菌B家族DNA聚合酶应用的报道.