高效液相色谱-电喷雾质谱联用分析亚硝基脲导致的DNA股间交联

为了探讨亚硝基脲类抗癌药物对DNA的股间交联作用,以合成的1-[N-(2′-脱氧胞基)]-2-[N-(2′-脱氧鸟基)]乙烷(dG-dC)为标准品,使用高效液相色谱-电喷雾串联质谱(HPLC-ESI-MS/MS)方法测定了小牛胸腺DNA中1,3-双(2-氯乙基)-1-亚硝基脲(BCNU)导致的DNA股间交联物。DNA样品经过变性、酶解和离心过滤后,以乙酸铵溶液和乙腈为流动相,经C18反向色谱柱分离。样品经电喷雾离子源(ESI)正离子化后,采用质谱一级和二级全扫描进行定性分析;采用选择反应扫描(SRM)方式,以m/z521→289作为检测的离子碎片,测定DNA样品中dG-dC的含量。本研究为DNA股间交联的定性和定量分析提供了有效的方法。

氯乙基亚硝基脲导致DNA股间交联的荧光光谱法研究

氯乙基亚硝基脲(CENUs)是重要的临床抗癌药物,其抗癌作用机制与导致DNA股间交联密切相关。使用荧光光谱法对其导致的DNA股间交联进行定量分析。结果表明,交联率随着反应时间的延长逐渐增加,司莫司汀(Me-CCNU)和卡莫司汀(BCNU)的交联率分别约在8 h和5 h达到最大值,且药物浓度越大,交联率增加越快。比较了Me-CCNU和BCNU对DNA交联作用的反应动力学,发现分解较慢的Me-CCNU与DNA的交联过程中存在一段明显的"诱导期";而分解较快的BCNU与DNA的交联反应则不存在"诱导期",且BCNU浓度过高或反应时间过长均会使交联率下降。该文为阐明CENUs导致DNA交联的反应动力学和反应机理提供了依据。

1-[N(2′-脱氧胞基)]-2-[N-(2′-脱氧鸟基)]乙烷的合成及其在DNA股间交联检测中的应用

以2′-脱氧鸟苷,2′-脱氧胞苷,2-氟乙醇等为原料合成了1-[N-(2′-脱氧胞基)]-2-[N-(2′-脱氧鸟基)]乙烷(dG-dC),其结构经1HNMR,IR和MS表征。以dG-dC为标准品,用HPLC-MS对1,3-双(2-氯乙基)-1-亚硝基脲导致DNA股间交联的损伤产物进行了定性分析。

尼莫司汀和卡莫司汀导致细胞中DNA股间交联的高效液相色谱-电喷雾质谱联用研究

氯乙基亚硝基脲（CENUs）是临床常用的烷化剂类抗癌药物,主要通过导致DNA股间横向交联（dG-dC交联）发挥其抗癌作用。为建立高灵敏度的细胞中交联物的检测方法,评价不同种类CENUs的抗癌活性及耐药性,本研究使用尼莫司汀（ACNU）和卡莫司汀（BCNU）对具有不同O6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶（AGT）活性的NIH/3T3和L1210两种细胞进行药物处理,利用高效液相色谱-电喷雾串联质谱（HPLC-ESI-MS/MS）联用技术对经不同浓度药物处理后细胞中的dG-dC交联进行定量分析。该方法的检测限（S/N=5）和定量限（S/N=17）分别达到2fmol和8fmol,回收率为92.5%~107.4%,灵敏度和准确性均满足定量分析的要求。结果表明：ACNU导致的dG-dC交联率高于BCNU;经相同浓度的同种药物作用后,L1210细胞中交联率显著高于NIH/3T3细胞。这可为新型CENU类烷化剂的抗癌活性评价提供可靠的实验方法。

化学致癌作用是一种DNA股间交联

用碱洗脱法证明了两个致癌的多环芳烃苯并 [a]芘、二苯并 [a ,h]蒽 ;两个致癌的金属离子的盐 ,即铍盐和镉盐 ;4个致癌的芳香胺 ,即 2 氨基芴、2 萘胺、4 氨基联苯和联苯胺均引起DNA股间交联和DNA 蛋白质之间的交联 .而相应的非致癌剂苯并 [k]萤蒽、蒽、镁离子、锌离子、1 萘胺、2 氨基联苯和间甲苯胺则不能引起交联 .表明上述致癌物质均引起DNA股间交联或DNA 蛋白质间的交联 ,而与双区理论的预言一致 .本方法也可作为判别致癌剂与非致癌剂的一种方法 .

雌激素诱发DNA股间交联及其致癌和促癌协同作用

雌激素Ａｍｅｓ实验显阴性，但动物实验及流行病调查证明雌二醇和已烯雌酚均具致癌性．根据致癌机理的双区理论推论，雌激素也是由于引发ＤＮＡ互补碱基共价交联而启动致癌作用．借ＤＮＡ碱洗脱法证明，雌二醇和乙烯雌酚经代谢活化均剂量相关地引起ＤＮＡ－蛋白质间和ＤＮＡ股间交联，而非致癌剂胆甾醇和芘均不能引起交联．已知雌激素与多环芳烃污染具有彼此的增效致癌作用．不能诱发交联的非致癌剂芘与雌二醇共同培育，则总交联率和ＤＮＡ股间交联率分别达雌二醇单独存在时的４倍及３倍，表明雌二醇不仅诱发芘生成双自由基，而芘又反过来促进雌二醇双基的更多生成．

DNA股间交联及与细胞癌变关系的研究进展

癌症是目前全球共同面临的重大公共卫生问题。流行病学研究显示,大约80%～90%的人类癌症是由环境因素诱导产生的,其中又以化学因素占主导地位。化学致癌机理的双区理论认为,环境致癌物经体内代谢生成特定的双官能团烷化剂,从而诱导DNA双链互补碱基对之间的交联并最终引发癌症。目前针对DNA股间交联的检测方法已有不少研究,然而DNA股间交联如何引起细胞癌变的机理仍悬而未决,这也成为人们关注的焦点。本文旨在通过综述近年来对DNA股间交联的研究,从其结构、体内形成过程和检测方法等方面,探讨DNA股间交联与细胞癌变的关系,为环境致癌机理的研究提供思路。

荧光法和液相色谱-质谱联用法测定司莫司汀导致λDNA交联率的比较研究

司莫司汀是重要的抗癌烷化剂,其抗癌机制与导致DNA股间交联有关。使用荧光法和高效液相色谱-电喷雾串联质谱联用(HPLC-ESI-MS/MS)法对司莫司汀导致的λDNA交联率进行了测定。结果表明:药物浓度为2,4,8和16 mmol/L时,荧光方法测得的最大交联率分别为8.81%,11.17%,17.61%,和23.39%;HPLC-ESI-MS/MS方法测得的最大交联率为每107个碱基对中分别含有138,256,378和433个dG-dC交联。通过比较,荧光法测得的是交联DNA双链的含量,而HPLC-ESI-MS/MS法测得的是实际交联碱基对的个数,后者更能从本质上揭示交联率的变化规律。两种方法均表明交联反应初期存在一段交联率上升缓慢的"诱导期",这为阐明交联机理提供了依据。

石棉借诱发DNA股间互补碱基交联而启动癌变

２０世纪８０年代初以来，戴乾圜根据其双区理论预言：辐射、石棉、异物植入等所谓物理致癌因子，也是通过诱发ＤＮＡ互补碱基股间交联而启动癌变．借碱稀释洗脱法证明， 石棉通过诱发细胞中氧化酶产生活化的过程，剂量相关地引发ＤＮＡ股间交联和ＤＮＡ－蛋白质间交联，其中ＤＮＡ股间交联达８０％以上．亚铁离子借Ｆｅｎｔｏｎ反应使交联率成倍地提高，维生素Ｃ则以因子８～９抑制交联，表明交联是由羟基自由基ＨＯ所诱发．非致癌剂芘或内源性致癌剂雌二醇分别与石棉共存时的不同交联增效作用，以及亚铁离子对两者的不同增效作用和维生素Ｃ的不同抑制作用，进一步证明交联是由ＨＯ所诱发．基于ＡＭ１计算指明了交联产物的可能结构，并借ＨＯ诱发的突变谱进一步证明了这些结构的存在．

AGT介导的氯乙基亚硝基脲耐药作用机理的密度泛函理论研究

氯乙基亚硝基脲(CENUs)是一类重要的抗癌烷化剂,通过导致DNA互补鸟嘌呤-胞嘧啶之间的共价交联(GC交联)发挥抗肿瘤作用。然而,O^6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)对DNA烷化损伤的修复作用能够导致肿瘤细胞对CENUs产生耐药性。使用密度泛函理论(DFT)方法结合分子对接对AGT介导的CENUs耐药机制进行研究。结果表明,AGT能够与CENUs导致GC交联的两个前体物——O^6-氯乙基鸟嘌呤(O^6-ClEtG)和N1,O^6-桥亚乙基鸟嘌呤(N1,O^6-EtG)结合形成复合物,然后通过氢迁移和烷基转移两步反应,对这两个前体物进行修复,从而阻断GC交联的形成。在AGT对两个前体物的修复过程中,N1,O^6-EtG的修复在动力学和热力学上比O^6-ClEtG的修复均具有优势,但O^6-ClEtG更有利于与AGT形成复合物。阐明了AGT介导的CENUs耐药机制,这将为开发AGT抑制剂用于与CENUs联合用药以消除耐药性提供重要的理论依据。