小鼠NGF基因治疗型DNA质粒的构建及中试工艺的优化

目的构建小鼠NGF基因治疗型DNA质粒,并进行中试工艺的优化。方法用SignalP3.0 Server软件选择并设计与NGF融合的信号肽;根据哺乳动物密码子偏爱性,对小鼠NGF的编码序列进行优化;通过流加补料等方式优化中试生产工艺;体外瞬时转染测定DNA质粒的表达和体外生物学活性。结果所构建的含有IgG/ngf的重组质粒,通过中试规模的发酵和纯化,获得了大量的高纯度重组质粒,该重组质粒可以在体外表达出具有生物学活性的NGF。结论构建了具有与小鼠NGF相似的生物学活性的重组质粒,并建立了中试生产工艺。

小鼠神经生长因子基因治疗型DNA质粒的质量控制

目的对小鼠神经生长因子(NGF)基因治疗型DNA质粒进行质量控制。方法用酶切鉴定法和PCR法进行DNA质粒的结构确认,鸡胚背根神经节法和免疫印迹测定DNA质粒表达产物的生物学活性,分光光度法测定浓度,琼脂糖凝胶电泳法和DNA-NPR-HPLC法测定纯度,气相色谱法测定乙醇和异丙醇残留量,琼脂糖凝胶电泳法测定RNA残留量,其余检测项目按《中国药典》三部(2005版)规定进行。结果用上述方法对原液和成品进行了检定,各项指标均符合《预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则》和《中国药典》三部(2005版)的要求。结论所采用的质控方法和质量标准能够保证该DNA质粒的安全、有效,可用于治疗型DNA质粒的质控。

植物线粒体DNA质粒研究进展

本文列出了已发现的高等植物中的线粒体DNA质粒 ,按分子形状分为线粒体环状DNA质粒和线粒体线状DNA质粒 ,环状线粒体DNA质粒的特征是分子较小 ,序列中有正向 /反向重复序列 ,ORF一般较小。线状线粒体DNA质粒的特征是分子较大 ,末端有重复序列 ,5’端与蛋白质共价结合 ,有较长的ORF。还分别介绍了它们的复制机制、转录和起源。质粒间及质粒与核基因组、线粒体基因组、叶绿体基因组的同源性也作了介绍。最后 ,综述了植物线粒体DNA质粒与植物的细胞质雄性不育 (CMS)

质粒DNA实验室规模化制备工艺

目的 探索实验室规模生产质粒DNA(plasmid DNA,pDNA)的制备工艺。方法 选用质粒pEGFP-N1E. coli Stbl3菌株,用最陡爬坡试验(plackett-burman,PB)筛选出影响质粒产量最显著因素,响应面法优化重组菌高产发酵条件。采用碱裂解,浓缩质粒,通过凝胶、亲和、离子等层析分离纯化pDNA,并对所纯化的pDNA进行质量评价。结果 用PB试验和响应面试验设计筛选出的关键因素是:酵母提取物20 g/L,甘油6 g/L,接种物浓度吸光度(optical density,OD)=0.014。在最佳条件下进行3次平行发酵,生物量OD 600达28.07±2.01,质粒产量(21.34±1.31)mg/L。pDNA纯度(A260 nm/A280 nm)为1.91±0.02。内毒素含量小于0.005 EU/g DNA;几乎检测不到蛋白质及细菌基因组DNA残留,达到相关质量标准。结论 本研究采用的制备工艺可生产出高质量的p DNA。

混合模式层析分离纯化超螺旋质粒DNA

针对细胞裂解液中的超螺旋质粒DNA(sc pDNA)的分离,以质粒pVAX1为典型对象、采用Capto PlasmidSelect作为混合模式层析介质,探讨了料液中主要成分sc pDNA、开环质粒DNA(oc pDNA)和RNA的吸附行为,优化了分离条件,实现了从成分较为复杂的料液中高效分离sc pDNA。考察了上述3种组分的静态吸附,发现在(NH_(4))_(2)SO_(4)浓度c(NH_(4))_(2)SO4为1.9~2.5 mol·L^(-1)时,sc pDNA均具有较高的吸附量,确定c(NH_(4))_(2)SO_(4)=2.5 mol·L^(-1)的料液可直接上样,此时sc pDNA饱和吸附量为每克介质吸附3.3 mg。动态吸附实验发现,sc pDNA穿透略晚于oc pDNA,sc pDNA动态载量为每毫升介质负载2.00 mg,RNA吸附能力明显强于pDNA。进一步优化了洗脱、冲洗和上样量等分离条件,采用c(NH_(4))_(2)SO_(4)=2.5 mol·L^(-1)上样、c(NH_(4))_(2)SO_(4)=1.9 mol·L^(-1)冲洗、(c(NH_(4))_(2)SO_(4)=1.7 mol·L^(-1))+(cNaCl=0.3 mol·L^(-1))洗脱,sc pDNA纯度可达83.9%、同质性高达95.8%、收率为80.6%。结果表明,混合模式层析对sc pDNA选择性好、处理量较大,具有良好的应用价值。

密码修饰可增强沙眼衣原体MOMP DNA质粒免疫小鼠的免疫应答

目的探讨密码修饰对沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因表达和DNA质粒免疫的影响。方法根据人类密码子使用偏好对鼠肺炎沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis mouse pneumoni-tis)MOMP基因进行优化修饰,设计合成人源化MOMP基因(HuMOMP)。构建以pcDNA3为载体的含HuMOMP及含野生型MOMP基因(WtMOMP)的真核表达质粒。瞬时转染COS-1细胞,Western blot方法比较HuMOMP基因及WtMOMP基因在哺乳动物细胞中的蛋白表达水平。DNA质粒肌内免疫BALB/c小鼠,检测小鼠血清特异性抗体、DTH和淋巴细胞增殖反应,比较优化密码MOMP基因和野生型MOMP基因DNA质粒免疫的免疫效果。结果人工合成HuMOMP基因,成功构建重组真核表达质粒pcDNA3-HuMOMP及pcDNA3-WtMOMP。转染细胞Western blot结果显示,HuMOMP基因的蛋白表达水平明显高于WtMOMP基因。ELISA结果表明,HuMOMP DNA质粒免疫组小鼠血清特异性IgG抗体有所升高;细胞免疫检测结果显示,HuMOMP DNA质粒免疫组小鼠足垫肿胀程度增强、淋巴细胞增殖实验刺激指数(SI)增高,两者与WtMOMP DNA质粒免疫组相比P<0.05,差异均有统计学意义。结论人源化密码修饰能够增强沙眼衣原体MOMP基因在哺乳动物细胞中的蛋白表达及DNA质粒免疫小鼠的免疫反应,这对于新型衣原体DNA疫苗的研究具有重要意义。

改善大分子质粒DNA重组效率的新方法

采用两次连接法对一个质粒载体为 7 65kb ,插入子为 1 4 7kb的片段进行重组连接 ,使连接效率大大提高 .此方法对于大分子的质粒DNA重组是非常有效的 .

碱裂解法提取质粒DNA的研究

对质粒DNA及其结构、形态和功能进行了综述 ,介绍了碱裂解法提取质粒DNA的基本步骤 ,并对其提取过程中的注意事项进行了剖析 。

碱裂解法提取细菌质粒DNA的改良

碱裂解法是目前最为广泛应用的细菌质粒DNA的提取方法。但该法提取DNA所需时间较长,通常需要2h以上。为了快速提取质粒DNA,对常规碱裂法中溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、RNA酶A及无水乙醇的反应时间由原来的5min、5min、10min、30min、10min分别缩短至5s、1min、5s、10min、5min。这种改良方法极大地缩短了DNA的提取时间,可在30min内完成整个DNA的制备,且制备的DNA可直接应用于进一步的酶切、连接及PCR等各种分子生物学分析。

一种简便快捷的植物线粒体质粒DNA的提取方法

介绍了一种从植物材料中提取线粒体质粒 DNA的方法 ,该方法不需要密度梯度离心和有机溶剂抽提 ,整个提取过程可在较短时间内完成 .该方法简便、快捷、效果好 ,对拷贝数低的线粒体质粒

快速制备酵母质粒和基因组DNA PCR模板

发展了一个利用煮沸法快速制备酵母质粒和基因组DNAPCR模板的程序 。

麝致病性大肠杆菌的质粒DNA分析(英文)

[Objective] The pathogenic Escherichia coli in musk deer was classified at molecular level to provide basic materials for molecular epidemiology of pathogenic Escherichia coli in musk deer. [Method] Plasmids from 24 pathogenic Escherichia coli in musk deer were extracted by the Lysis Triton method, and then identified by single enzyme digestion with three endonucleases of Hind Ⅲ, EcoR Ⅰ and BamH Ⅰ. [Result] The yield rate of plasmids was 91.6%, and 24 pathogenic Escherichia coli in musk deer had the identical or similar plasmid profiles. [Conclusion] Plasmid DNA analysis offers scientific basis for molecular epidemiology of pathogenic Escherichia coli in musk deer in Sichuan Institute of Musk Deer Breeding.

质粒DNA小量提取法的改进

介绍了一种改进的小量提取质粒DNA的方法,该方法用NH4Ac和LiCl代替常规方法中苯酚和氯仿的抽提,有效去除了样品中RNA和蛋白质;用95%乙醇代替无水乙醇沉淀质粒DNA,降低了终产物中盐和多糖等杂质的含量,获得的质粒DNA质量好,产率高,能满足常规分子生物学实验的要求,如PCR、酶切、转化大肠杆菌以及植物遗传转化.

农杆菌质粒DNA提取方法的改良与鉴定

常规的农杆菌质粒DNA提取常采用碱裂解和酚、氯仿提纯方法 ,得率较低 ,一般在 5 0ng μl以下。针对常规碱裂解法的不足 ,利用含有pCGⅡ双价载体的LBA4 4 0 4菌株通过增加菌液收集量、改变提取流程中的反应条件等对常规方法进行了改良 ,去除了酚、氯仿提纯过程 ,减少了提取过程对人体的伤害 ,得率一般在 0 .5～ 2 μg μl。所提取质粒DNA可直接用于PCR。

营养条件对pcDNA3-HBS质粒DNA生产的影响

为了考查营养条件对质粒DNA的生产影响 ,采用不同的培养基培养含pcDNA33 HBS质粒的大肠杆菌JM10 9。实验结果表明 :碳源、氮源对质粒DNA产量有明显的影响。葡萄糖是质粒合成过程中较佳的碳源 ,蛋白胨是较佳的氮源。在M9P培养基中 ,选择合适的硫酸铵浓度对质粒DNA的生产有一定的作用。由于Gly ,Asp ,Glu能提供合成核苷酸的氮源 ,在M9G培养基中添加 1 2g L的Asp ,1 0g L的Glu和 0 4g L的Gly后 ,经 2 0h培养 ,质粒产量可达 2 5mg L。外源核苷也影响质粒DNA的产量 ,通过添加 0 4g L胞苷与胸苷的混合物 (摩尔比为 1∶1)到M9P培养基中 ,质粒DNA的产量可达 35mg L。

治疗用质粒DNA的纯化工艺

目的探索适合大规模生产治疗用质粒DNA的纯化工艺。方法采用中空纤维柱收菌、碱裂解,再应用中空纤维柱浓缩质粒,经分子筛、亲和、离子交换等层析分离纯化质粒DNA,并应用凝胶电泳、PCR、核酸蛋白检测仪、BCA蛋白检测试剂盒和内毒素检测试剂盒对所纯化的质粒DNA进行全面检定。结果所获得的超螺旋质粒DNA达到样品总质粒的91.2%;质粒DNA总纯度为1.8;内毒素含量小于10EU/mg;几乎检测不到蛋白质残留,未检出基因组DNA残留。各项指标均符合有关质量标准。结论所采用的纯化工艺省时省力,制备的质粒DNA纯度高,适用于大规模生产治疗用质粒DNA。

一种改良式质粒DNA提取方法的建立与应用

目的建立一种稳定、可靠的质粒DNA提取改良方法,探讨其在分子生物学实验研究中的应用价值。方法将含有目的质粒的菌株扩增后,运用改良后的碱裂解法进行质粒DNA小量提取,微量核酸仪测定提取质粒DNA的产量及纯度;采用琼脂糖凝胶电泳、内切酶酶切及质粒转染真核细胞鉴定提取质粒DNA的质量及转染效率。结果改良式质粒提取方法获得质粒DNA产量为3.2 mg/L菌液,A260/280=1.91;内切酶酶切完全;质粒DNA以超螺旋结构为主;真核细胞转染效率为20%左右。结论改良式质粒DNA抽提方法操作简单、实用,获得质粒DNA产量多、质量高,能达到分子生物学常规实验的要求。

双歧杆菌的药敏性及其质粒DNA的检测

利用药敏纸片琼脂扩散法检测了10株具有粘附性的双歧杆菌对临床常用的12大类38种抗菌药物的药敏性。结果显示,对于同一菌株,其对同类抗菌药物表现出基本一致的药物敏感性;不同菌株间在对于同一类药物的敏感性上也有着较好的吻合,如对青霉素类、喹诺酮类、氨基糖甙类及多肽类的表现几乎全为耐药,对头孢类、大环内酯类、磺胺、氯霉素、克林霉素则基本表现为敏感。但在此基础上,不同来源的菌株间也存在着一定的差异。采用碱裂解法提取并检测了受试双歧杆菌的耐药性质粒,仅在一株受试双歧杆菌H-3中发现有1条质粒带,其对应的核酸分子量参照在5148～21226bps之间,其他受试菌株中未发现有质粒存在。

黄瓜线粒体中DNA类质粒的分离与鉴定

应用琼酯糖凝胶电泳、S1酶处理及电镜技术 ,从黄瓜线粒体中分离并鉴定了三种环形 DNA类质粒 ,依其分子由大到小 ,分别称之为 p C1、p C2和 p C3.以类质粒凝胶电泳带的荧光扫描值与 DNA类质粒的分子长度之比作为类质粒拷贝数的参照值 ,对三种类质粒进行荧光扫描分析 ,结果表明 p C3拷贝数明显高于 p C1和 p C2 ;p C2的拷贝数略高于 p