猪精子细胞电穿孔及DNA转染的新途径

用动物精子作为外源DNA载体已成为转基因的主要方法之一,外源DNA通过精子导入后代,有可能简化转基因动物的生产.目前转基因最普遍采用的是微注射法,但其技术要求高、实验设备昂贵、效率低,导致生产成本高.因而寻找一种简单、高效的转基因方法具有重要的意义.

用于DNA转染的PRRSV全长感染性cDNA克隆改建及应用

[目的]利用核酶自我剪切功能使PRRSV的基因组获得1个精确的基因组3′末端,提高全长感染性cDNA克隆的病毒拯救效率。[方法]用3步PCR方法将获得含有丁型肝炎病毒核酶序列的片段并将其克隆到PRRSV全长cDNA克隆pAPRRS的poly(A)下游,再通过酶切,连接将牛生长激素多聚腺甘酸转录终止序列插入到核酶序列后,构建成全长感染性cDNA克隆pAPRRS-HB,新构建的克隆转染MARC-145细胞,72h后用间接免疫荧光检测病毒N蛋白和非结构蛋白2(nsp2)的表达,并检测细胞上清中病毒的滴度。[结果]成功构建了含有核酶序列的PRRSV基因组全长感染性cDNA克隆pAPRRS-HB。新构建的全长感染性cDNA克隆能够较好地拯救出病毒,拯救效率比pAPRRS提高10倍左右。[结论]该结果为研究PRRSV基因结构与功能奠定了基础。

脂质体介导TGF-β_1质粒DNA转染家兔角膜上皮细胞的实验研究

目的 :确定转化生长因子 β1(TGF β1)质粒DNA能否由脂质体携带进入家兔角膜上皮细胞 ,为角膜上皮细胞的研究提供方法。方法 :体外培养家兔角膜上皮细胞 ,用多聚阳离子脂质体携带重组的人的TGF β1质粒 ,向家兔角膜上皮细胞转染 ,在转染 12h后 ,表达 2d时 ,用免疫组化方法(SABC)检测TGF β1质粒DNA在家兔角膜上皮细胞的表达情况。结果 :外源TGF β1质粒DNA在家兔角膜上皮细胞中可以获得表达 ,在转染 12h后 ,表达 2d时的基因转染率为2 3%。结论 :稳定的外源基因可由脂质体介导转入生长中的收稿日期 :2 0 0 2 -0 3 -0 4;修回日期 :2 0 0 2 -0 4-10基金项目 :湖北省自然科学基金资助项目 (NO .98J0 70 )。作者简介 :黄琼 (1977-) ,女 ,湖北人 ,在读博士研究生 ,研究方向 :角膜病。通信作者 :黄琼 (E -mail:joanhuang77@2 1cn .com)。家兔角膜上皮细胞内 ,借此方法 ,可从外源基因入手 ,对角膜上皮细胞的生理、病理活动的机制进行研究 ;作为角膜上皮细胞基因类药物介入的基础研究和应用研究的介导体 。

用于DNA转染的PRRSV全长感染性cDNA克隆改建及应用(英文)

[目的]利用核酶自我剪切功能使PRRSV的基因组获得1个精确的基因组3′末端,提高全长感染性cDNA克隆的病毒拯救效率。[方法]用3步PCR方法将获得含有丁型肝炎病毒核酶序列的片段并将其克隆到PRRSV全长cDNA克隆pAPRRS的poly(A)下游,再通过酶切,连接将牛生长激素多聚腺甘酸转录终止序列插入到核酶序列后,构建成全长感染性cDNA克隆pAPRRS-HB,新构建的克隆转染MARC-145细胞,72h后用间接免疫荧光检测病毒N蛋白和非结构蛋白2(nsp2)的表达,并用检测细胞上清中病毒的滴度。[结果]成功构建了含有核酶序列的PRRSV基因组全长感染性cDNA克隆pAPRRS-HB。新构建的全长感染性cDNA克隆能够较好地拯救出病毒,拯救效率比pAPRRS提高10倍左右。[结论]该结果为研究PRRSV基因结构与功能奠定了基础。

转铁蛋白SA阳离子脂质体介导DNA转染肝癌细胞SMMC-7721的实验研究

目的 检测HTf(Fe) 2 SA阳离子脂质体是否具有靶向转染肝癌细胞的能力。方法 在有血清和无血清两种条件下检测HTf(Fe) 2 SA阳离子脂质体和SA阳离子脂质体介导DNA进入肝癌细胞SMMC -772 1和小鼠B16黑色素瘤细胞内的量。结果 在有血清和无血清两种转染条件下HTf(Fe) 2 SA阳离子脂质体介导入SMMC -772 1细胞内DNA的量明显高于SA阳离子脂质体 ,而对小鼠B16黑色素瘤细胞两者无明显差异。结论 HTf(Fe) 2

脂质体介导TFPI-2质粒DNA转染兔角膜基质细胞的实验研究

目的 探讨角膜基质细胞组织因子途径抑制物 2 (TFPI- 2 )的表达情况 ,为角膜新生血管的基因治疗提供方法。方法 体外兔角膜基质细胞原代、传代培养 ;脂质体介导人类TFPI- 2真核表达载体pBos -Cite -neo/TFPI- 2转染角膜基质细胞 ,RT -PCR ,Westernblot技术检测转染前后基质细胞中TFPI- 2mRNA及相应蛋白质的表达水平。结果 转染前后基质细胞TFPI- 2mRNA的表达水平IATFPI-2 /IAβ -actin分别为 0 .5 6± 0 .0 4、0 .78± 0 .0 3;蛋白质的表达水平IA值分别为 1 8.4± 1 .3、2 4 .2± 0 .5 ,差异均有显著意义。结论 培养角膜基质细胞可基础表达一定量的TF PI- 2 ,转染TFPI- 2质粒后使基质细胞TFPI- 2mRNA和蛋白质的表达增高 。

DNA转染淋巴细胞表达宫颈癌细胞膜抗原

目的：证明抗宫颈癌单克隆抗体（ｍ Ａｂ）ＡＵ１４ － １ 识别的宫颈癌抗原决定簇是肿瘤相关基因表达的产物。方法：将宫颈癌（Ｕ１４） 细胞ＤＮＡ 转染原代培养正常淋巴细胞；分别用细胞和夹心酶联免疫吸附试验（ ＥＬＩＳＡ） 检测ＤＮＡ转染细胞膜表面抗原。结果：转染细胞如同Ｕ１４ 细胞一样对ＡＵ１４ － １ 染色呈阳性反应；ｗｅｓｔｅｒｎ 印迹法分析表明，转染细胞膜表面可溶性抗原呈现４ 条与Ｕ１４ 细胞一致的分子量为２０ ０００ 、４６ ０００ 、６１ ０００ 和６５ ０００ 的蛋白多肽区带。结论：宫颈癌细胞膜表面抗原是肿瘤相关基因编码的低分子量糖蛋白。

基于柔性微电极芯片活体电穿孔提高PD-1质粒DNA转染效率

目的开发一种柔性微电极芯片提高以PD-1质粒为模版的DNA转染效率。方法运用微机电系统加工柔性衬底的微电极芯片,在体外对HEK293细胞进行电转染GFP质粒,验证柔性微电极芯片的可靠性。在活体动物进行电穿孔转染PD-1质粒实验,BALB/C小鼠共分3组,每组5只,分别给予0 V·cm^(-2),100 V·cm^(-2),200 V·cm^(-2)不同电场强度进行电穿孔,间接ELISA法检测电转后不同时间点的血清中抗PD-1抗体滴度。结果制备的柔性微电极芯片,能够转染GFP质粒到HEK293细胞内表达蛋白;在活体实验中,采用微电极芯片电穿孔免疫5次后2周,小鼠血清中PD-1抗体达到峰值。结论基于柔性微电极芯片的活体电穿孔能够有效提高DNA转染效率,增强免疫应答。

表面活性蛋白A-聚赖氨酸结合物将DNA转染至培养的呼吸道细胞中

肺表面活性蛋白A(SP-A)是在肺泡裘面含量非常丰富的一种表面活眭剂相关蛋白。本文研究将SP-A通过共价键与21kD的聚赖氨酸交联形成结合物[Lys]21kD-SP-A作为载体，体外转染人的肺腺癌细胞系H441细胞。将分子量为20900D的酸与纯化的ASP-A经化学方法人工合成[Lys]21kD-SP-A结合后与携带细菌氯霉索乙酰基转移酶(CAT)基因的质粒pCPA-RSV混合并感染H441细胞，

脂质化可改善外源DNA转染鸡精子细胞效率

印度中央家禽研究所研究人员将鸡精子细胞和3种外源DNA,完整的线性pVIVO2-GFP/LacZ载体（9620bp）、LacZ基因（5317bp）和GFP基因（2152bp）共孵育,使外源DNA转染精子细胞。PCR试验、DotBlot和Southern杂交试验显示,鸡精子细胞成功内化外源DNA。

上海创建大规模细胞DNA转染技术平台

上海交通大学肿瘤研究所等单位的科研人员经过多年攻关，创建了大规模细胞DNA转染技术平台，通过该平台可直接筛出具有影响细胞生长、肿瘤发生发展相关基因，具有重要的潜在的应用与开发价值。该研究日前获得2004年上海市科技进步一等奖。

乙型肝炎病毒DNA转染与鸭乙型肝炎病毒DNA感染原代鸭肝细胞对比研究

目的 探讨HBVDNA复制和表达的跨种属特异性 ,为HBVDNA转染跨种属原代肝细胞模型的建立提供实践基础和理论依据。方法 分离培养原代鸭肝细胞 (PDH) ,电转线性HBVDNA(转染组 ,1.19× 10 12 拷贝 / 1× 10 7PDH)或急性感染DHBV (感染组 ,4× 10 8病毒颗粒 / 1× 10 7PDH) ,分别于转染 /感染后 1d、3d、5d等时点检测PDH培养上清或裂解液中HBsAg、HBeAg与DHBsAg (采用IMX系统或ELISA检测 ) ;并采用DotBlotting检测PDH裂解液中总HBVDNA。于转染 /感染后 2d提取PDH总DNA采用SouthernBlotting分析HBVDNA与DHBV复制型式。以单纯电击或未感染的PDH为对照组。结果 转染后 1d、3d和 5d各时点转染组PDH裂解液中HBsAg分别为 15 .2 4、14.5 5和5 13 (P/N值 ,阳性≥ 2 .1) ,HBeAg均为阴性 ;PDH培养上清中HBsAg与HBeAg均阴性 ;感染组各时点PDH上清中DHBsAg分别为 14.6、31.5 3、34.73(S/N值 ,阳性≥ 2 .1) ;上述各项指标于对照组均为阴性。DotBlotting显示转染组与感染组PDH各时点的裂解液中HBVDNA与DHBVDNA均为阳性 ,对照组为阴性 ;SouthernBlot分析显示 :转染组HBVDNA与感染组DHBV均为游离复制型 ,可见 4.0kb以下分子涂抹带 ,包括rcDNA、cccDNA(scDNA )和ssDNA等复制中间体 ;未见整合型HBVDNA 高分子区(4～ 2 4kb)?

治疗性双质粒HBV DNA疫苗的体外转染表达与鉴定

目的:探讨治疗性双质粒HBVDNA疫苗转染COS-7细胞后目的基因的表达情况。方法:以脂质体转染试剂LipofectamineTM2000介导,将带有preS2+S基因的重组疫苗质粒pS2.S和带有hIL2+hIFNγ融合基因的重组佐剂质粒pFP分别转染COS-7细胞,同时设立空质粒转染和未转染细胞为对照组,于转染后24,48,72,96h采用ELISA法检测细胞培养上清的HBsAg、融合蛋白白细胞介素(IL-2)及干扰素(IFN-γ)的表达,并测定融合蛋白的IL-2、IFN-γ活性,采用ECLWesternblotting分析和鉴定目的蛋白preS2+S、IL-2及IFN-γ的分子质量大小。结果:双质粒在转染COS-7细胞后不同时间均可进行分泌表达,且48h时目的蛋白的表达量达峰值,其中表达的融合蛋白具有较高的IL-2和IFN-γ的生物学活性,pS2.S和pFP的转染上清分别在30.6ku和110ku处有特异性阳性反应条带。结论:HBVDNA疫苗质粒pS2.S和佐剂质粒pFP在COS-7细胞的最佳表达时间是转染后48h,并鉴定双质粒表达产物的分子质量大小分别为30.6ku和110ku。

DNA－转染体细胞系产生单克隆抗体

本文研究淋巴细胞转染体的产生和转染体单克隆抗体的抗原结合特性．以小鼠宫颈癌细胞系Ｕ１４为抗原免疫小鼠。以制备的Ｕ１４和小鼠骨髓瘤细胞系Ｓｐ２／０ＤＮＡ分别转染经Ｕ１４免疫的小鼠原代脾细胞．将所形成的转染体细胞进行克隆，建成２株淋巴细胞转染体细胞系ＵＤ和ＳＤ．它们能连续生长于含血清和无血清培养液中，但不能在同基因小鼠体内生长．ＵＤ和ＳＤ细胞系所产生的单克隆抗体不仅能与小鼠宫颈癌细胞表面抗原及其可溶性抗原发生特异反应，且能识别人宫颈癌组织和宫颈癌病人血清中的肿瘤抗原决定簇．本实验结果进一步证明了我们提出的肿瘤＂进化抗原＂理论，并提示瘤细胞ＤＮＡ转染造成的淋巴细胞永生化，可能是产生人源性单克隆抗体具有前景的途径．

通过xCELLigence系统实时监测低毒性X-tremeGENE DNA转染实验

研究背景 X—tremeGENE DNA Transfection Reagent是非脂质体的多组分转染试剂，已成功应用于多种细胞的转染实验。X—tremeGENE 9和X-tremeGENE HP在有无血清存在的条件下均可进行转染，且细胞毒性低，转染后无需更换培养基。

用家蚕核型多角体病毒DNA基因组转染细胞系NISES—BOMO—15AIIC的有效脂染法

家蚕细胞系(BOMO—15AIIC)(Inoue等,1990),对家蚕核多角体病毒(BmNPV)和对几种质型多角体病毒(CPV)易感,通常用此细胞系来进行各种研究,诸如杆状病毒介导的组蛋白的表达,研究在离体条件下复制时CPVS与BmNPV的相互影响以及在实验室条件下CPV表达载体的发展.所有这些研究都需要使用高效的方法来将病毒基因组转染到细胞之中.

HCMV在基因转染细胞中复制的研究

用人喉上皮细胞癌细胞系(HEP_2)的DNA转染人胚肺细胞(HEL),得到了5株基因转染细胞(GTC),命名为A5、B3、G8、D3和H3.这些GTC的染色体数在HEL的染色体数与两个亲代细胞(HEP-2和HEL)染色体的和数之间,感染人巨细胞病毒ADI69株后4d,D3比A5、B3、G8和H3有更多的荧光阳性细胞和更高的病毒滴度.在D3中HCMV复制随感染剂量的增大而增速.不同代数的D3对HCMV具有相似的敏感性,HCMV感染传至100代的D3,电镜证实仍可象原代D3复制大量的HCMV.永生性的D3可以用作分析调控HCMV复制的宿主细胞因子、分离培养HCMV等的工具.

磷酸钙转染方法的优化

通过比较293T细胞的接种密度、质粒DNA的量以及CO2浓度对磷酸钙转染方法的影响,确定最佳的转染条件.以各单因素试验的最适条件为依据,设计三因素三水平的正交试验.结果表明,磷酸钙介导质粒DNA转染,当293T细胞的接种密度为5×105/mL、质粒DNA的量为30μg、细胞培养环境CO2浓度为3%时,转染效果最佳.