非同源末端连接中DNA连接酶Ⅳ抑制剂研究进展

DNA连接酶Ⅳ(LIG4)主要通过非同源末端连接(NHEJ)参与V(D)J重组和DNA双键断裂(DSB)修复,具有独特调控作用和广泛应用前景。研究发现,LIG4抑制剂在NHEJ中可作为增敏剂,与放化疗联合治疗肿瘤时具有较好的抗癌效果。此外,LIG4抑制剂还可作为一种有效的生化抑制剂介导CRISPR/Cas9基因编辑,有提高基因编辑效率的作用。近年来,许多研究基于此机制不断进行大规模药物筛选以发现新型抗癌药物,来为肿瘤治疗提供一种新思路。现对目前已报道的LIG4抑制剂及其衍生物的各种形式进行综述,并重点介绍目前应用较广的SCR7。

小分子化合物靶向DNA连接酶Ⅳ提高CRISPR/Cas9基因编辑效率的研究进展

基因编辑工具能够在DNA链上制造特定位点双链断裂(Double-strand breaks,DSB)。细胞内具有修复DSB的2种不同途径,即同源重组(HDR)和非同源末端连接(NHEJ)。NHEJ与HDR之间相互竞争,互为替代DNA修复途径。DNA连接酶Ⅳ参与NHEJ途径并发挥重要作用。DNA连接酶Ⅳ抑制剂可以抑制DNA修复通路中NHEJ的效率,同时可以提高HDR的效率。为了优选小分子化合物实现更有效的基因定点插入,综述了SCR7、NU7026、白藜芦醇、L755507这4种不同的小分子化合物在CRISPR/Cas9基因编辑效率上的研究,归纳了这4种小分子化合物在其中发挥的作用,并用生物信息学软件模拟所用小分子化合物与DNA连接酶Ⅳ的对接。在此基础上,对这4种小分子化合物提高基因编辑效率的研究前景进行了展望。

靶向DNA连接酶Ⅳ小分子抑制剂SCR7提升CHO-K1细胞定点整合效率研究

目的应用DNA连接酶Ⅳ(Lig4)的小分子抑制剂SCR7处理中华仓鼠卵巢(CHO)-K1细胞,验证其能否提高CHO-K1细胞中由CRISPR/Cas9介导的外源基因在ROSA26安全位点的定点整合效率。方法构建靶向CHO-K1细胞ROSA26位点的特异性pX330-sgRNA-ROSA26质粒以及带启动子失活的GFP报告基因同源打靶载体,摸索并确定SCR7在CHO-K1细胞内作用的适宜浓度及处理时间,通过流式细胞术检测SCR7对CHO-K1细胞定点整合效率,同时评价剂量范围内SCR7对细胞凋亡的影响。结果在CHO-K1细胞中成功构建靶向ROSA26位点的GFP报告系统,该系统可用于验证CRISPR/Cas9介导的定点整合效率;确定了SCR7对CHO-K1细胞作用的合适剂量和处理时间,在该条件下SCR7对CHO-K1细胞无明显细胞毒性;证实了SCR7在剂量范围内能有效提升外源基因在CHO-K1细胞ROSA26位点的整合效率,且对细胞凋亡无明显影响。结论SCR7能提升CHO-K1细胞定点整合效率,该发现为应用Lig4小分子抑制剂构建具备高效表达外源基因的重组CHO细胞系奠定了基础。

分子对接、CRISPR/Cas9技术筛选并验证DNA ligase Ⅳ抑制剂

为了筛选靶向DNA连接酶Ⅳ的抑制剂以实现更有效的基因定点插入,采用分子对接技术筛选出与前期研究中靶向DNA连接酶Ⅳ的抑制剂SCR7作用类似的小分子化合物。筛选到与化合物库一致的nocodazole、Fisetin和Methylene blue 3个小分子化合物,通过用MSTN基因T11位点序列截断的Firefly Luciferase荧光素酶报告载体结合CRISPR/Cas9-gRNA-T11载体共转细胞,并结合不同的小分子化合物处理。结果表明,没有用小分子化合物处理时,萤火虫荧光素酶被截断的位置发生NHEJ修复,不能得到大量有活性的萤火虫荧光素酶;经过小分子化合物处理,抑制了细胞内的NHEJ,提高了HDR效率,能得到大量有活性的萤火虫荧光素酶。使用nocodazole、Methylene blue和Fisetin处理后的萤火虫荧光素酶检测结果65256.3、53713和77058.3分别是SCR7处理后的萤火虫荧光素酶检测结果41905.3的1.6、1.3和1.8倍,是没有SCR7处理后的萤火虫荧光素酶检测结果10120的6.4、5.3和7.6倍。证明所用的筛选策略正确,所筛选出的小分子化合物是具有DNA ligaseⅣ抑制活性的抑制剂,为后续研究奠定了基础。

DNA双链断裂修复与重症联合免疫缺陷

DNA双链断裂(double-strand breaks,DSBs)是细胞DNA损伤的主要类型,它的修复通过同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)两种机制实现。NHEJ是人和哺乳动物细胞DSBs修复的重要通路,主要由DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)、X射线修复交叉互补蛋白4(XRCC4)、DNA连接酶IV、Artemis、XLF/Cernunnos和其它DNA损伤修复辅助因子组成。本文重点介绍了NHEJ机制主要成分的特性及其功能,以及这些组分的基因发生突变或缺失所引起的DSBs修复缺陷与辐射敏感性重症联合免疫缺陷(radiosensitive severe combined immunodeficiencies,RS-SCIDs)。

Omenn综合征致病基因的研究进展

Omenn综合征(OS)是一种罕见的常染色体隐性遗传的免疫缺陷病,是重症联合免疫缺陷的一种。其临床表现主要以红皮病、肝脾和淋巴结肿大、反复感染为特征,并可伴有自身免疫表现。常伴有IgE以及嗜酸性粒细胞增多,B淋巴细胞缺如。OS的发生与抗原受体V、D、J的重组异常有关,最常见的是重组激活基因的突变。V、D、J重组过程还有Artemis、DNA连接酶Ⅳ等物质的参与,相应基因突变也会导致OS。该文主要讨论关于OS致病基因的研究进展,帮助理解OS发生的病理过程,并为OS的诊断提供思路。

造血干细胞移植治疗原发性免疫缺陷病3例

苏州大学附属儿童医院2017年10月至2019年5月收治了3例分别患有选择性IgA缺乏症、X连锁无丙种球蛋白血症、DNA连接酶Ⅳ缺乏症的患儿,均进行了造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)。选择性IgA缺乏症1例和X连锁无丙种球蛋白血症1例,行HSCT后虽有出现支原体及呼吸道感染,但均在抗感染治疗后好转,并已返校上学。DNA连接酶Ⅳ缺乏症1例,行HSCT后出现毛细血管渗漏综合征(capillary leak syndrome,CLS)和肝静脉闭塞症(hepatic veno-occlusive disease,VOD),经心包穿刺、胸腔闭式引流、血浆置换、血液净化等治疗,病情仍持续进展,回输后68 d因多器官功能衰竭死亡。