为了筛选靶向DNA连接酶Ⅳ的抑制剂以实现更有效的基因定点插入,采用分子对接技术筛选出与前期研究中靶向DNA连接酶Ⅳ的抑制剂SCR7作用类似的小分子化合物。筛选到与化合物库一致的nocodazole、Fisetin和Methylene blue 3个小分子化合物...为了筛选靶向DNA连接酶Ⅳ的抑制剂以实现更有效的基因定点插入,采用分子对接技术筛选出与前期研究中靶向DNA连接酶Ⅳ的抑制剂SCR7作用类似的小分子化合物。筛选到与化合物库一致的nocodazole、Fisetin和Methylene blue 3个小分子化合物,通过用MSTN基因T11位点序列截断的Firefly Luciferase荧光素酶报告载体结合CRISPR/Cas9-gRNA-T11载体共转细胞,并结合不同的小分子化合物处理。结果表明,没有用小分子化合物处理时,萤火虫荧光素酶被截断的位置发生NHEJ修复,不能得到大量有活性的萤火虫荧光素酶;经过小分子化合物处理,抑制了细胞内的NHEJ,提高了HDR效率,能得到大量有活性的萤火虫荧光素酶。使用nocodazole、Methylene blue和Fisetin处理后的萤火虫荧光素酶检测结果65256.3、53713和77058.3分别是SCR7处理后的萤火虫荧光素酶检测结果41905.3的1.6、1.3和1.8倍,是没有SCR7处理后的萤火虫荧光素酶检测结果10120的6.4、5.3和7.6倍。证明所用的筛选策略正确,所筛选出的小分子化合物是具有DNA ligaseⅣ抑制活性的抑制剂,为后续研究奠定了基础。展开更多
文摘DNA双链断裂(double-strand breaks,DSBs)是细胞DNA损伤的主要类型,它的修复通过同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)两种机制实现。NHEJ是人和哺乳动物细胞DSBs修复的重要通路,主要由DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)、X射线修复交叉互补蛋白4(XRCC4)、DNA连接酶IV、Artemis、XLF/Cernunnos和其它DNA损伤修复辅助因子组成。本文重点介绍了NHEJ机制主要成分的特性及其功能,以及这些组分的基因发生突变或缺失所引起的DSBs修复缺陷与辐射敏感性重症联合免疫缺陷(radiosensitive severe combined immunodeficiencies,RS-SCIDs)。