基于改进的DNA连接酶链式反应发现NOD2基因多态性与冠心病的相关性

目的:本研究改进基于脱氧核糖核酸(DNA)连接酶的中低通量基因分型方法,并用此方法进行核苷酸结合寡聚结构域(NOD)样受体基因NOD1和NOD2与冠心病的关联分析。方法:通过多重聚合酶链式反应(PCR)预扩增增加连接模板分子数量,提高特异性连接效率,优化DNA探针设计,摸索连接反应温度、时间、循环圈数及连接酶种类实现等位基因特异性连接,通过荧光掺入PCR和毛细管电泳实现多种等位基因特异性产物一次性检测。Sanger测序验证此方法准确性后,利用此方法对NOD1和NOD2基因上的单核苷酸多态性(SNP)位点在1 555例冠心病患者和1887例对照受试者中进行分型和关联分析。结果:通过优化反应条件和等位基因特异性探针设计原则,实现10 ng DNA样本一次性分型30个等位基因多态性位点。基于改进的DNA连接酶中低通量基因分型方法,NOD1、NOD2基因与冠心病的关联分析发现,NOD2基因上rs1861759和rs751271位点在非高血压条件下与冠心病相关(P均<0.05),经Bonferroni多重检验校正后,相关性仍然显著(P均<0.05)。结论:本研究优化了DNA连接酶链式反应技术在设计上的关键点,联合使用多重PCR和毛细管电泳,建立了一种高准确性、低成本、满足基于中低通量位点分型的临床分子诊断和科研需求的基因分型新方法,并用该方法发现NOD2基因上的位点rs1861759和rs751271在非高血压条件下与冠心病相关。

连接酶-ELISA反应检测循环DNA基因突变研究

目的研究一种简便、灵敏的单核苷酸多态性(SNP)分型方法,使其能够在简单实验条件下进行常规的临床样本检测。方法设计针对突变位点的检测探针,通过检测探针的连接、通用扩增、标记和ELISA反应,根据检测位点对应反应管显色值判定突变位点的基因型。以表皮生长因子受体(EGFR)基因外显子21和18上的3个SNP突变位点L858R、L861Q和G719C为检测对象,对62例肺癌血浆循环DNA样本进行检测,并与直接测序结果进行比较。结果通过对3个突变位点的检测,2种方法均在L858R位点检出杂合子突变。直接测序法仅能够明确检出2例杂合子突变,另外1例样本因在突变位点出现不明显的套峰而无法明确判定突变类型。而新方法能够明确检出6例杂合子突变。结论建立了一种基于连接酶-ELISA的简便、灵敏的SNP突变检测方法,适合于在简单实验条件下对不均一样本进行常规突变检测。

《癌表观遗传学:人类癌的生物分子治疗》

表观遗传指诸如DNA甲基化作用、组蛋白甲基化和乙酰化作用等非DNA序列改变可引起基因表达和染色质组织的遗传状态改变的现象。 表观遗传机制调节从怀孕到死亡的所有生物学过程,包括：细胞生长、早期胚胎发生和配子形成阶段的基因组重编程；

桑树DNA连接酶Ⅰ基因MuLigI的获取和序列分析

为进一步研究DNA连接酶Ⅰ在类病毒复制中的作用,以感染桑花叶萎缩类病毒的桑树叶片为材料,通过在同源基因保守区设计简并引物进行PCR扩增和c DNA末端扩增,获取桑树DNA连接酶Ⅰ基因。结果获得桑树DNA连接酶Ⅰ基因Mu Lig I长2730 bp的m RNA序列,基因编码区长2367 bp,编码788个氨基酸,含典型的DBD结构域（173~351 aa）和CD催化结构域（405~771 aa）,N端含有核定位（NLS）和线粒体定位信号（MLS）。研究所得桑树DNA连接酶Ⅰ基因具有保守的结构域和活性位点,可能和番茄的DNA连接酶Ⅰ基因一样,参与了桑花叶萎缩类病毒的复制过程。

分子标记在竹类植物遗传多样性保护中的应用

竹类植物与人类的生存和生活密切相关,对其在DNA水平上的遗传多样性研究具有重要的理论和实践意义。分子标记是基因型的特殊的易于识别的表现形式,它是生物分类学、育种学、遗传学和物种起源与进化等研究的主要技术指标之一。本文综述了几种常用的DNA分子标记(RFLP、RAPD、AFLP等)在竹类植物种质资源鉴定、分类、亲缘关系、遗传多样性和起源进化等方面的研究进展,同时进一步展望了分子标记在濒危竹种保护和研究中的应用前景。

藻类rDNA特异性片段长度多态性在溺死鉴定中的应用

目的通过检验水体和人体器官中硅藻核糖体DNA(rDNA) 5.8S部分序列、第二内转录间隔区(second internal transcribed spacer,ITS2)序列(5.8S+ITS2)的长度多态性差异,判断溺水死亡案件中受害人的落水地点以及受害人系生前落水还是死后被抛尸入水。方法以南京市公安局法医中心受理的2例硅藻检验鉴定案例为对象,利用5.8S+ITS2分子标记的长度多态性,分析藻类生物在水体、人体组织中种群结构的差异。结果案例1中,在受害人肺、肝组织和水体样本中均检出种类相近的硅藻,利用5.8S+ITS2分子标记在死者肺组织和水体样本中均检出330 bp和376 bp两种DNA片段,确定受害人系生前溺水。案例2中,在死者肺、肝组织中均未检出硅藻,利用5.8S+ITS2分子标记在死者肺组织中仅获得1条DNA片段,长度为331 bp,相对荧光单位值非常低,确定受害人系死后抛尸入水。结论本方法检验两案例的实验结果符合实际案情和硅藻镜检的结论,利用5.8S+ITS2分子标记研究水体和人体组织中特定微生物的种群结构差异,从而判断溺水死亡的落水地点以及受害人系生前落水还是死后被抛尸入水等问题具有可行性。

表观遗传学在中枢神经系统退行性疾病中的研究进展

表观遗传学调控通过DNA甲基化和组蛋白修饰等方式改变DNA的表达水平,在中枢神经系统退行性疾病中发挥重要作用。目前,越来越多的疾病应用表观遗传学原理研制新型药物,为阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和肌萎缩侧索硬化症等中枢神经系统退行性疾病的治疗提供新的方法。本文主要总结表观遗传学在中枢神经系统退行性疾病中的研究进展,同时探讨以表观遗传学为依据的治疗方法的临床应用。

表观遗传学修饰在多发性硬化症中作用的研究进展

多发性硬化症既是经典的神经免疫性疾病,又是神经退行性疾病。越来越多的证据表明,表观遗传学改变与多发性硬化症的发病相关。表观遗传学修饰可以影响基因的表达,但不会改变DNA的序列。DNA甲基化、组蛋白修饰和微小RNA相关基因转录和翻译的调控是表观遗传的3种重要机制。表观遗传学可能通过调节多发性硬化症的病因(包括遗传易感性和环境危险因素)和发病机制(包括炎症脱髓鞘和神经退行性变化的机制)的多个环节影响多发性硬化症的发病。本文综述了表观遗传学修饰在多发性硬化症发生中的作用,并为从表观遗传学角度治疗多发性硬化症提出建议。

在大鼠局灶性脑缺血再灌注早期DNA修复酶APE/Ref-1表达水平对修复功能的影响

目的:探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注早期,皮质和尾壳核中DNA修复酶APE/Ref-1的表达变化情况及其意义。方法:40只SD大鼠单纯随机分为正常组和手术组,其中手术组根据不同时间点分为再灌注6,24和72h组,每组10只动物。通过苏木精-伊红染色方法观察再灌注早期的损伤情况,采用免疫组化和免疫荧光方法检测APE/Ref-1的表达变化。结果:再灌注6,24,72h,皮质损伤区域APE/Ref-1的表达分别为(28.9±8.7),(26.5±10.8),(12.8±6.8)个/视野,与正常组(68.1±12.2)个/视野比,均显著下降(F=2182.92,P<0.01);尾壳核损伤区域APE/Ref-1的表达分别为(21.3±9.8),(20.6±7.6),(13.5±7.3)个/视野,与正常组(72.4±14.7)个/视野比,均显著下降(F=2453.79,P<0.01),并始终维持于较低水平,同时皮质损伤区域细胞胞浆内出现APE/Ref-1的异常表达。结论:再灌注早期DNA修复酶APE/Ref-1表达水平的降低及其在胞浆中的滞留,提示损伤区域DNA修复功能下降,并可能因此促进DNA损伤的积累和发展。

非同位素法分析序列特异性DNA结合蛋白的三种方法

目的为在转录调控水平研究蛋白质异常表达机制,利用核转录因子与相应DNA调控序列特异结合的原理,非同位素法分析细胞内序列特异性DNA结合蛋白。方法凝胶滞留实验(EMSA)采用Dig-ddUTP末端标记DNA,核蛋白粗提或纯化产物与之液相结合后,PAGE分离核蛋白并转印至尼龙膜,化学发光法检测结果,Southwestern分析方法首先采用SDS-PAGE分离核蛋白粗提或纯化产物,蛋白转印至膜上后与Dig-dUTP末端标记的DNA杂交,酶免疫学检测结果,磁性DNA结合蛋白纯化法则将靶DNA与商品化磁性DNA粒子相连,用不同的连接、洗脱条件得到序列特异性靶DNA结合蛋白,银染显示核蛋白纯化结果。结果 EMSA中由于游离DNA与DNA-蛋白复合物有不同电泳迁移率,出现滞后DNA条带提示有识别该特定DNA序列的核蛋白存在,Southwestern分析除能提示核抽提物中有无可与DNA结合的核蛋白外,还提示其中核蛋白分子质量,核蛋白粗提物经磁性DNA亲和层析后DNA结合蛋白在银染时出现较纯的特异识别该DNA序列的核蛋白条带。结论 EMSA,Southwestern分析及磁性DNA层析是3种实用的研究DNA结合蛋白的方法,配伍应用具有简便、重复性好、敏感性和特异性高、无同位素污染等优点,是转录调控水平研究疾病相关基因异常表达的有效方法。

变性高效液相色谱分析法在人类基因组单核苷酸多态性检测中的应用

目的:检测白种人和汉族人RDH8基因序列中单核苷酸多态性(SNP)位点,探讨变性高效液相色谱分析法(DHPLC)在基因组研究中的效能。方法:建立8个由白种人和汉族人基因组DNA组成的混合样品池,并进行PCR扩增。其产物以DHPLC检测,发现杂合子信号后,对单独DNA样本进行DHPLC检测及直接测序确定其突变类型。以DHPLC结合DNA样本混合技术在150个汉族人和20个欧洲白种人样本中测定SNP的基因频率。结果:在RDH8基因中共检测到17个SNP,其中12个为新发现的,5个为已报道的;11个SNP在筛查阶段发现,6个在基因频率检测阶段发现;2个仅在白种人样本中检测到,3个SNP的MAF在两种人种间有较明显的差异;汉族人基因频率检测确定了7个常见SNP。结论:DHPLC能有效地用于基因组SNP的检测,结合DNA混合技术,更能提高其检测效力,有效地应用于基因频率的测定。

互隔交链孢霉毒素对DNA的损伤作用

共价闭环超螺旋ＤＮＡ变为缺口环状和／或线性ＤＮＡ时，ＤＮＡ链要发生肤裂。利用这一原理来检测互隔交链孢霉毒素：交链孢酚（ＡＯＨ）、交链孢酚单甲醚（ＡＭＥ）引起ＤＮＡ链的断裂。结果表明，这两种物质对ＤＮＡ都有直接损伤作用，但是它们的作用强度和方式是不相同的，ＡＯＨ对ＤＮＡ的损伤作用强，并可与ＤＮＡ结合。

遗传和表观遗传机制在先天性心脏病中的研究进展

先天性心脏病是胎儿期心脏及大血管发育异常所致的先天性畸形,是最常见的出生缺陷之一。先天性心脏病病因复杂,染色体异常、基因突变、核酸修饰、非编码RNA等遗传和表观遗传机制在其发生过程中发挥重要作用。现阶段,染色体异常、基因突变等遗传机制已经广泛应用于临床疾病的诊断与治疗。然而,针对遗传及表观遗传修饰在先天性心脏病的诊疗应用仍需深入研究。本文综述了染色体异常、基因突变、拷贝数变异及表观遗传修饰与先天性心脏病发生的关系,以期为进一步探究先天性心脏病早期诊断及个体化治疗提供依据。

靶向生物痕迹发现仪在接触类生物检材案件中的应用

目的探讨靶向生物痕迹发现仪在公安实战中的应用价值。方法在一起抢劫案现场提取的砖头上喷洒显影试剂,暗室环境下激光照射,经滤光发现荧光斑迹后,用植绒拭子提取,随后进行DNA检验,验证提取斑迹位置是否准确。结果靶向生物痕迹发现仪准确显示了嫌疑人在砖头上的触摸部位,DNA检验证实,两处荧光斑迹处擦拭物均检出单一有效STR分型,成功比中DNA数据库中的犯罪嫌疑人。结论靶向生物痕迹发现仪对发现、提取接触类检材如石头、砖块等载体上的触摸痕迹物证有较高的导引性,对法医DNA检验鉴定有应用价值。

泛素连接酶CUL4A-DDB1复合体参与DNA损伤修复的研究进展

泛素化修饰在DNA损伤信号中发挥重要功能,包括细胞周期监控、DNA修复、细胞衰老和程序性死亡的调控。CUL4A-DDB1泛素连接酶通过DCAFs靶向调控特异性的底物,启动DNA切除修复机制对受损DNA进行修复。近期的研究表明CUL4A-DDB1泛素连接酶协助DNA修复因子与受损DNA的识别,来维持基因组的稳定性和正确性。

琥珀酰辅酶A连接酶缺陷导致继发性甲基丙二酸尿症四例的临床与实验室研究

【摘要】目的探讨因琥珀酰辅酶A连接酶缺陷导致的继发性甲基丙二酸尿症患儿的临床与基因特点。方法对2011年2月至2014年4月北京大学第一医院儿科确诊的琥珀酰辅酶A连接酶缺陷导致的甲基丙二酸尿症中国患儿4例的临床经过、生化异常、脑影像特点及基因突变进行研究。结果4例患儿于生后1d至6个月发病，于6个月至2岁8个月就诊，均有智力运动落后，喂养困难，肌张力低下，3例合并难治性癫痫，听力障碍。血清乳酸、丙酮酸均增高。尿甲基丙二酸9．21～9．97mmol／mol肌酐（正常值0．2～3．6mmol／mol肌酐），血液丙酰肉碱5．07～8．15μmol／L（正常值0．5～4．0μmol／L），琥珀酰肉碱1．98～4．49txmol／L（正常值0．15～1．0μmol／L）。外周血白细胞线粒体呼吸链酶复合物存在单一或复合缺陷。头颅MRI显示基底节损害或脑萎缩。3例为SUCLGl基因缺陷，共检出5种突变（c．809A〉C、c．826—2A〉G、c．550G〉A、c．751C〉T和c．961C〉G突变）。1例为SUCLA2c．970C〉T纯合突变，为新突变。经治疗后，4例患儿智力运动缓慢进步。结论琥珀酰辅酶A连接酶缺陷患儿起病早，临床表现缺乏特异性，预后不良。对于轻度甲基丙二酸尿症伴严重神经系统损害及高乳酸血症的患者需注意鉴别琥珀酰辅酶A连接酶缺陷症尿症，基因诊断是关键方法。

白血病ID4基因核心启动子区甲基化及其表达

目的:探讨DNA结合抑制因子4(inhibitor of DNA binding 4,ID4)基因核心启动子区甲基化及其蛋白表达与儿童急性白血病(acute leukemia,AL)的关系。方法:采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific polymerase chain reaction,MS-PCR)对32例初发白血病患儿、34例同期非肿瘤疾病儿童(对照组)及白血病细胞株Jurkat和Molt4进行ID4基因启动子区甲基化状况分析,并进行测序。RT-PCR检测ID4 mRNA的表达,免疫组织化学法检测ID4蛋白的表达。结果:ID4基因启动子区在Jurkat和Molt4细胞中均呈完全甲基化状态,而初发急性淋巴细胞及非淋巴细胞白血病患儿中完全甲基化率显著高于对照组患儿(81.0%vs17.6%,P<0.001;63.6%vs17.6%,P<0.005)。测序分析显示在完全甲基化状态的ID4基因核心启动子区所有CpG岛均呈甲基化状态。呈完全甲基化状态的白血病患儿和Jurkat、Molt4细胞中均无ID4 mRNA表达,而白血病组ID4蛋白表达显著低于对照组(P<0.001)。结论:儿童白血病及某些白血病细胞株存在ID4基因核心启动子区高程度的甲基化。完全的甲基化状态可使ID4基因表达沉默,ID4蛋白表达缺失。

胃癌DAPK基因甲基化的初步研究

目的探讨死亡相关蛋白激酶(death-associate dprotein kinase,DAPK)基因甲基化与胃癌的关系。方法采用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)检测38例配对胃癌组织、癌旁正常组织和转移淋巴结中DAPK基因甲基化的情况。结果81.6%(31/38)的胃癌组织中存在异常甲基化,而相应的癌旁正常组织和转移淋巴结中该基因的甲基化率分别为42.1%(16/38)和70.2%(27/38)。癌组织和转移淋巴结中DAPK基因甲基化的发生率显著高于癌旁正常组织。癌旁正常组织中,该基因甲基化与年龄相关,P=0.020。但与肿瘤大体类型、分化程度及浸润深度等临床病理特征无关。结论DAPK基因异常甲基化是胃癌发生发展过程中的频发事件,通过检测胃黏膜组织及转移淋巴结中该基因的甲基化情况,可能会对胃癌的诊断及判断淋巴结的微转移提供一定的参考价值,并有望成为胃癌新的基因治疗靶点。

XRCC2基因多态性与肺癌易感性关系的研究

目的：探讨中国北方人群中XRCC2基因C41657T、G4234C多态性与肺癌的关系。方法：应用PCR-RFLP方法检测199例肺癌患者和200例正常人的XRCC2 C41657T及G4234C多态位点，比较两组之间等位基因及基因型频率分布及其与肺癌的关系。结果：肺癌患者XRCC2 C41657T多态位点的CC、CT、TT基因型和C、T等位基因频率分布与健康对照组相比差异均无统计学意义（P〉0．05）。G4234C多态位点的GG、GC、CC基因型和G、C等位基因频率分布与健康对照组相比差异也均无统计学意义（P〉0．05）。两多态性位点联合分析显示，肺癌患者与健康对照组的4个单体型分布亦无统计学差异（P〉0．05）。以病理类型、吸烟状况和年龄进行分层分析显示，XRCC2 C41657T多态位点可能与腺鳞癌和不吸烟人群的肺癌发病风险相关；与C／C基因型相比，携带T等位基因的基因型（C／T＋T／T）可显著增加腺鳞癌的发病风险（OR为2．95，95％CI=1．15—7．59）；而C／T基因型可显著增加不吸烟组人群中肺癌的发病风险（OR为2．12，95％CI=1．05-4．27）。对于XRCC2 G4234C多态位点，与G／G基因型相比，G／C基因型和携带C等位基因的基因型（G／C＋C／C）可显著增加小细胞肺癌的发病风险（OR为2．82和2．82；95％CI=1．15～6．91和1．17～6．76）；G／C基因型或与C／C基因型相加可显著增加年龄≥60岁的人群中肺癌的发病风险（OR为2．29和2．37；95％CI=1．11—4．72和1．16—4．88）。结论：对于XRCC2 C41657T多态位点，携带T等位基因的基因型可能增加腺鳞癌的发病风险，C／T基因型可能增加不吸烟者患肺癌风险；XRCC2 G4234C多态位点，G／C基因型或携带C等位基因可能增加小细胞肺癌的发病风险和老年人（年龄≥60岁）患肺癌的风险。