DNA连接酶4缺乏症致反复肺炎1例报告

DNA连接酶4缺乏症(DNA ligase IV syndrome,LIG4),又称LIG4综合征(OMIO#606593),是一种与联合免疫缺陷相关的罕见常染色体隐性遗传病。临床主要表现为小头畸形、鸟样面容、生长发育迟缓、皮肤异常和全血细胞减少[1]。本文报告1例LIG4综合征患儿的临床资料,并回顾国内外相关病例的临床特征,以提高临床医师对该疾病的认识。1病历资料患儿女,2岁1月龄,因咳嗽伴喘息半个月入院。咳嗽无明显诱因,伴喘息,起病6 d后咳嗽渐加重,偶可呕出大量黄色及白色黏痰。

T4DNA连接酶对电转化效率的影响

目的探讨T4DNA连接酶影响电转化效率的机制并寻找提高电转化效率的方法。方法将1μg噬粒pDAN5加入到连接反应体系中并进行沉淀、热灭活以及酚氯仿抽提等各种处理后进行电转化。结果热灭活、酚氯仿抽提、热灭活后沉淀及热灭活后酚氯仿抽提处理后的转化效率最高(4.6×108￣5.3×108),其次是沉淀处理(4.8×107),未处理的转化效率最低(4.4×106)。结论 T4DNA连接酶的活性是导致电转化效率降低的主要原因,任何可以灭活该酶活性的方法均可显著地提高转化效率。

T4 DNA连接酶酶活力测定方法

工具酶的酶活力检测是工具酶产品质量控制的关键,研究和建立工具酶酶活力的测定方法是工具酶产品标准化制定的重点和难点。该文采用改进的粘性末端单位测定T4 DNA连接酶酶活力。经验证,方法重复性好,稳定性佳,为建立T4 DNA连接酶质量检测标准奠定了基础。

基于线性荧光探针对T4 DNA连接酶的活性分析

利用线性荧光探针作为核酸连接反应的模板和信号分子,通过实时监测荧光信号的降低来表征连接产物的生成过程,从而建立了一种连续、简单且特异性高的T4 DNA连接酶活性分析的新方法,检出限可达1.2 U/mL;同时,该方法还可用于快速考察金属离子和化学药物对酶促反应的影响.实验结果表明,该法不仅为灵敏、实时监测核酸连接反应提供了一种简便快捷的非同位素分析方法,也为开展核酸连接酶活性分析、反应动力学机制探讨和药物快速筛选提供了一种新技术.

T_4 DNA连接酶介导的5’RACE法克隆大鼠Nor 1全长cDNA

目的:克隆75AEST全长cDNA序列。方法:抽提在25mmol/L KCl条件下培养7d的大鼠小脑颗粒神经元的总RNA后,用DNA连接酶介导的5’RACE法克隆75A表达序列标签(EST)cDNA5’端未知序列,其产物亚克隆到pGEM-Teasy后进行序列测定以及同源性分性。结果:首轮5’RACE扩增出2.5kb序列后,75A EST鉴定为神经来源孤儿受体1(Nor1)基因的部分序列;再经过二次轮5’RACE,我们首次克隆Nor-1的全长cDNA序列。结论:T_4DNA连接酶介导的5’RACE是一种效率较高的克隆mRNA5’端未知序列的好方法,为进一步研究Nor1在小脑颗粒神经元存活或分化过程中的作用奠定基础。

DNA连接酶4及热休克蛋白B1基因单核苷酸多态性与鼻咽癌易感性的相关性

目的探讨DNA连接酶4(LIG4)和热休克蛋白B1(HSPB1)基因单核苷酸多态性与鼻咽癌易感性的关系。方法采用病例-对照研究和Taqman real-time PCR对193例鼻咽癌患者和211例健康对照组外周血DNA进行单核苷酸多态性的基因分型。结果 LIG4C/T(rs1805388)和HSPB1C/G(rs2868371)的基因型分布在鼻咽癌组和健康对照组之间无明显差异(P>0.05)。单因素及多因素分析显示LIG4C/T(rs1805388)和HSPB1C/G(rs2868371)位点多态性与鼻咽癌发生风险无关。结论 LIG4rs1805388和HSPB1rs2868371基因多态性与鼻咽癌易感性无关。

T4 DNA连接酶性质及其平端连接功能

T4 DNA连接酶(T4Lig)在基因工程中有重要作用,科研人员对该工具酶性质了解不全面易导致平端DNA连接效率很低、甚至失败.所以对T4Lig性质功能的全面认识有助于基因重组,特别是平端DNA连接中的应用.为了提高平端DNA连接效率,以及进一步阐明平端连接机理,本文综述了T4Lig酶分子大小、保真性、切口DNA连接机理、平端DNA连接端口检测、酶分子性质理性改造等研究进展,并对平端连接中有待解决的几个问题进行了展望.

额外的错配碱基提高T4 DNA连接酶等位特异性连接（英文）

连接是一种主要的DNA处理过程。由于较低的商业成本以及核酸底物识别的灵活性,T4DNA连接酶被广泛应用于生物分子工程,特别是特定核酸序列的等位特异性连接检测。本文评估了在T4 DNA连接酶介导的连接反应中,引入额外的错配碱基对所产生的影响。设计了超过150组DNA/DNA或DNA/RNA带有的额外错配碱基对的组合。结果发现,引入额外的错配碱基对后,T4 DNA连接酶在DNA/DNA连接中特异性可提高60倍以上,而在DNA/RNA连接中特异性只能提高2倍。在等位特异性连接中,有的错配碱基对可使T4 DNA连接酶的特异性提高600多倍。

利用T_4RNA连接酶在单链DNA/RNA的5'末端进行荧光、同位素以及生物素标记

利用Ｔ４ＲＮＡ连接酶在单链ＤＮＡ／ＲＮＡ的５′末端进行荧光、同位素以及生物素标记对于核酸研究来说ＤＮＡ／ＲＮＡ的末端标记是一项很重要的技术。酶法标记比有机化学法标记更简单方便。这是由于酶学反应具有温和、特异、可控制性和高效性的特点。酶法的３′端标记技...

融合蛋白Trx-T4 DL可溶性表达、纯化与其生物活性应用

构建含SUMO、IF2、GST、Nus A、Msy B、Trx和MBP融合标签的重组表达载体,转化到大肠杆菌E.coli Transetta(DE3)中进行自诱导(auto-induction,AI)表达,以提高T4 DNA连接酶(T4 DL)的表达产量。通过磁珠法检测融合蛋白的可溶性表达情况,10%SDS-PAGE电泳结果显示,重组菌Transetta(DE3)(p NBEVII-T4 DL)诱导表达的可溶性融合蛋白Trx-T4 DL的产量最多,经诱导培养条件优化后,Trx-T4 DL的可溶性大幅度提高,确定了最佳诱导条件为30℃、装瓶量50 m L/250 m L、接种量2‰、p H7。分别用镍柱和Mag Ni磁珠纯化重组菌破碎后上清中的融合蛋白Trx-T4 DL,结果显示后者纯化效率更高,最终获得的融合蛋白浓度为1700.462 mg/L。与其他公司T4 DL活性进行比较,检测其酶活性约为500 U/μL,并使其成功应用于低背景重组克隆载体构建中,为融合蛋白Trx-T4 DL的生产及应用提供理论基础。

条纹斑竹鲨鱼再生肝组织cDNA质粒文库的构建和鉴定

建立了鲨鱼肝脏的部分切除模型,获得了再生24h的鲨鱼肝组织,分离了再生肝组织的总RNA,纯化了mRNA,利用含BamHI酶切位点的Oligo(dT)16为引物合成cDNA第一链,通过末端转移酶在cDNA第一链3'末端加入Oligo(dC)尾,进而以Oligo(dT)16和含HindIII酶切位点的Oligo(dG)10为引物,通过LD-PCR (long- distance-PCR)方法合成双链cDNA,将双链cDNA经BamHI和HindIII双酶切,通过T4DNA连接酶连接到经相同酶切的pUC19载体后构建成cDNA文库.对文库质量的分析结果表明,通过本方法构建的鲨鱼再生肝组织cDNA文库容量至少为4.92×105个/μg dscDNA,重组率达96.7%.对随机提取30个克隆的质粒进行分析,获得了其中25个插入片段的序列,未见重复序列,经与GenBank和dbEST数据库比对分析发现新基因在其中占较大的比例(76%).鲨鱼再生肝组织cDNA文库的成功构建为进一步通过差异显示技术筛选、克隆肝再生过程中差异表达的相关功能基因奠定了一个良好的基础.

二(2-苯并咪唑亚甲基)胺合锰(Ⅱ)配合物水解切割DNA

本文合成并表征了二(2鄄苯并咪唑亚甲基)胺合锰髤配合物。我们利用凝胶电泳实验研究,发现该配合物在近生理条件下,能有效地切割双链pBR322DNA。通过采用在反应体系中加入自由基清除剂,无氧操作实验,脱水丙二醛产物分析,以及T4DNA连接酶连接实验等方法,确认该切割反应是通过水解途径进行的。进一步地,我们对切割反应进行了较详细的动力学研究,求出其催化速率常数Kcat为0.72±0.02h-1(pH=8,37℃)。

LIG4mRNA与XRCC4mRNA在宫颈癌中的表达及临床意义

目的探讨宫颈癌组织中DNA连接酶4(LIG4)及X射线修复交叉互补基因4(XRCC4)的mRNA表达水平及临床意义。方法应用实时荧光定量RT-PCR技术检测61例宫颈癌和20例正常宫颈组织中LIG4和XRCC4的mRNA表达水平,分析两种基因的表达与宫颈癌分期、分化程度及盆腔淋巴结转移之间的关系。结果 LIG4 mRNA和XRCC4mRNA在宫颈癌组织及正常宫颈组织中的表达分别为(2.88±1.97)、(5.02±1.87)和(2.16±0.99)、(3.72±1.36),差异有统计学意义,P值分别为0.00和0.00;宫颈癌患者盆腔淋巴结有转移组和无转移组中的表达分别为(0.61±0.17)、(0.41±0.28)和(0.80±0.31)、(0.58±0.26),差异有统计学意义,P值分别为0.00和0.01;宫颈癌低分化组和中高分化组中的表达分别为(1.81±0.99)和(2.03±1.25)、(1.50±0.76)和(1.45±0.57),差异无统计学意义(P>0.05)。LIG4 mRNA在Ⅱ期和Ⅲ期宫颈癌组织中的表达分别为(0.71±0.34)和(0.96±0.36),差异有统计学意义,P=0.01。LIG4 mRNA与XRCC4mRNA在宫颈癌组织中表达呈正相关(r=0.38,P=0.00)。结论 LIG4 mRNA和XRCC4 mRNA在宫颈癌组织中的异常表达与宫颈癌的发展及盆腔淋巴结转移密切相关。

DNA连接酶4基因T9I多态性与肿瘤易感性的Meta分析

目的系统评价DNA连接酶4基因T9I多态性与肿瘤易感性的相关性。方法计算机检索Pub Med、EMbase、h e Cochrane Library(2013年第10期)、CBM、CNKI、VIP及Wan Fang Data,收集关于DNA连接酶4基因T9I多态性与肿瘤易感性的病例-对照研究,检索时限均为从建库至2013年10月。由2位研究者按照纳入与排除标准独立筛选文献、提取资料并评价纳入研究的方法学质量后,采用Rev Man 5.0软件进行Meta分析。结果共纳入11个病例-对照研究,合计5 016例肿瘤患者和4 860例对照。Meta分析结果显示,DNA连接酶4基因T9I多态性与总人群肿瘤发病风险无相关性[TT+CT vs.CC:OR=0.96,95%CI(0.80,1.15),P=0.63;TT vs.CT+CC:OR=1.10,95%CI(0.78,1.56),P=0.59;TT vs.CC:OR=1.10,95%CI(0.73,1.64),P=0.65;CT vs.CC:OR=0.94,95%CI(0.80,1.11),P=0.48;T vs.C:OR=0.97,95%CI(0.82,1.15),P=0.75]。亚组分析提示,DNA连接酶4基因T9I多态性与亚洲人群发病风险无相关性,但与白种人群发病风险有相关性[TT+CT vs.CC:OR=0.87,95%CI(0.77,0.98),P=0.02]。结论 DNA连接酶4基因T9I多态性可能与白种人肿瘤的发病风险相关。

C_(60)/Cu^(2+)影响质粒DNA构象的复合效应研究

碳纳米材料的毒性效应日益受到广泛关注,通过比较研究多种非光催化条件下,富勒烯(C60)/Cu2+共存时对质粒DNA构象影响的复合作用,借以评估碳纳米材料的毒性效应。实验结果显示在非光催化条件下,C60/Cu2+可显著诱导DNA构象从超螺旋DNA转变成开环DNA,并且这种剪切效应随C60和Cu2+浓度的升高而增强;断裂后的DNA片段可重新被T4DNA连接酶连接成环状DNA,这说明C60/Cu2+的剪切位点为磷酸二酯键。另外,多种活性氧捕获剂均不能有效消除C60/Cu2+对DNA的剪切作用,这与Cu2+在DNA裂解中起主要作用相关。上述研究结果表明在非光催化条件下,C60/Cu2+可有效诱导DNA断裂,具有明显的复合效应,其潜在的基因毒性值得关注。

用高产菌株制备T_4—DNA连接酶

DNA连接酶是遗传工程研究工作中必不可少的工具酶,常用的有两类即大肠杆菌DNA连接酶及T4-DNA连接酶。其中T4-DNA连接酶不仅具有连接带有粘末端DNA片段的能力,而且还具有连接平末端DNA片段的能力,因而T4-DNA连接酶比大肠杆菌DNA连接酶的用途更大。

CRL4在增殖的肝细胞系中上调乙型肝炎病毒抗原的分泌表达

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)编码的X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)对HBV感染的启始和维持至关重要。HBx可能作为病毒来源的接头分子,介导Cullin-RING E3泛素连接酶4(CullinRING ubiquitin E3ligase 4,CRL4)复合物对染色体外DNA限制因子SMC5/6的降解。最近研究发现,CRL4接头分子DNA损伤结合蛋白1(DNA damage-binding protein 1,DDB1)可不依赖与HBx的相互作用而直接上调病毒的表达和复制。本研究基于HBx基因删除(X-null)的HBV重组共价闭合环状DNA(recombinant covalently closed circular DNA,rcccDNA)模型系统,在多种体外培养肝细胞系中证实上述发现。有意思的是,CRL4刺激rcccDNAX-null转染细胞抗原分泌表达的效应能被血清饥饿实验抵消。应用尾静脉高压注射小鼠模型,同样发现CRL4并不上调rcccDNAX-null在非增殖小鼠肝脏细胞中的表达。以上结果提示,细胞增殖特征与CRL4不依赖HBx上调病毒抗原分泌表达的效应密切相关,有助于HBx生物学意义的准确分析和理解。

曲古菌素A对食管癌EC9706细胞B淋巴细胞瘤-2、DNA连接酶4、共济失调毛细血管扩张突变基因表达影响

目的通过检测曲古菌素A(TSA)对食管癌细胞EC9706的B淋巴细胞瘤-2、DNA连接酶4、共济失调毛细血管扩张突变基因(atm)表达以及细胞增殖的影响,为进一步探讨TSA的辐射增敏机理提供依据。方法采用活细胞计数试剂盒(CCK-8)检测TSA对EC9706增殖的影响;实时荧光定量聚合酶链反应技术检测TSA处理与未处理的EC9706细胞的B淋巴细胞瘤-2、DNA连接酶4、atm的mRNA水平。结果一定浓度的TSA可显著抑制食管癌细胞EC9706的增殖,且癌细胞的相对存活率与TSA的浓度呈线性相关(P<0.05)。TSA同时下调了EC9706细胞的B淋巴细胞瘤-2、DNA连接酶4、atm 3个基因的mRNA水平。结论一定浓度的TSA在体外能显著影响基因B淋巴细胞瘤-2、DNA连接酶4和atm在EC9706细胞中的mRNA表达,可有效抑制食管癌细胞的增殖。

抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因的克隆及其原核表达载体的构建

目的 克隆抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因(VH)，并构建其原核表达载体。方法从能分泌抗人膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤细胞BDI-1中提取总RNA，通过RT-PCR扩增出VHcDNA。用HindⅢ和XhoⅠ酶切纯化的RT-PCR产物和原核表达载体pET28a(+)，在T4DNA连接酶作用下室温连接。重组质粒经酶切鉴定，阳性克隆测序并进行序列分析。结果扩增出VHcDNA片段，大小约为370bp，重组质粒的酶切鉴定结果与预期一致。VH基因序列长度为366bp，编码122个氨基酸。VH基因属于鼠免疫球蛋白重链11亚类。结论成功克隆出抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因，并成功构建其原核表达载体。

分子信标用于核酸连接过程的实时监测

建立了一种新的核酸连接实时监测方法, 利用分子信标作为核酸连接反应的DNA模板和检测分子, 在核酸分子连接的同时检测荧光信号. 实时、准确地获取核酸连接过程信息, 为核酸连接酶分析、核酸连接动力学过程研究提供全新、有效的手段, 也为深入研究核酸连接酶与核酸分子间的相互作用提供了新的思路与技术. 在此基础上建立了T4 DNA连接酶分析方法, 其线性响应范围为2.3(10-4 ～ 0.23 U/mL, 检测下限为2.3(10-4 U/mL.