EBV－DNA酶全基因扩增克隆和鉴定

根据Ｂｅａｒ的ＥＢ病毒（ＥＢＶ）基因全序列，设计包括ＥＢＶ特异性ＤＮＡ酶全基因的一对引物，在引物上设计有一个ＳａｌⅠ切点，以便于克隆。选用蛋白酶Ｋ裂解的Ｒａｊｉ细胞ＤＮＡ为模板，扩增出一条１４６０ｂｐ的特异条带，纯比后经ＴａｑⅠ酶切形成１１９８ｂｐ和２６２ｂｐ的两个片段，证实该扩增片段即为ＥＢＶ特异性ＤＮＡ酶的全基因片段。以ＪＭ１０３为宿主菌，以高效表达质粒ＰＢＶ２２１为载体，按常规方法作酶切、连接、转化，最后在含氨中青霉素的培养基上挑取单菌落扩大培养，用快速法少量制备质粒ＤＮＡ。根据质粒电泳结果粗筛，再行ＢａｍＨⅠ酶切初步鉴定，确定质粒大小为５１１７（１４５１＋３６６６）ｂｐ的菌落为阳性克隆。先后用ＢａｍＨⅠ和ＴａｑⅠ消化阳性重组体，以形成１２００ｂｐ和３９１７ｂｐ两片段的确定为正向连接重组体。

急性白血病患者DNA甲基转移酶基因的表达其及临床意义

为了探讨DNA甲基转移酶(DNMT)基因在成人急性白血病(AL)患者中的表达及其与临床预后之间的 关系,对72例AL患者和20例正常人的骨髓采用RT-PCR方法进行DNMT、p15INK4B、mdrl mRNA水平的检测;对 56例AL患者和14例正常人p15INK4B基因启动子区域CpG岛甲基化率,采用甲基化特异性PCR方法进行检测。结 果表明:AL患者组所有3种DNMT表达均明显高于对照组(P<0.01),改用细胞增殖核抗原(PCNA)为内对照, 差别仍有统计学意义。AL患者3种DNMT基因表达之间呈明显正相关,表现为协同的高表达;p15INK4B、mdrl与 DNMT表达呈明显负相关。DNMT因同时阳性患者组完全缓解(CR)率明显高于DNMT基因部分阳性或阴性 患者组(P<0.01)。p15INK4B基因在56例AL患者中,31例(55.4％)完全甲基化,12例(21.4％)部分甲基化,14例 正常人在同一条件下则无1例甲基化。结论:DNMT基因在成人AL患者有异常高表达,其可能通过促使抑癌基因 启动子区域过甲基化,而使其转录失活,从而导致白血病恶性克隆的形成。对于高表达DNMT的AL患者,可能对 化疗更敏感,提示DNMT基因高表达可能是临床预后较好的指标。

载体介导的人支气管上皮细胞DNA聚合酶β基因的靶向RNA干扰

目的运用载体介导的RNA干扰技术靶向抑制人DNA聚合酶β基因在支气管上皮细胞中的表达,为研究DNA聚合酶β在环境化学污染物所致DNA损伤修复中的功能和机制作准备。方法利用分子克隆技术构建含pU6启动子的人DNA聚合酶β基因RNA干扰特异性绿色荧光蛋白C1载体重组子“pEGFP-C1-U6-dsRNA”;以脂质体法将载体重组子转染人支气管上皮细胞,同时以空白细胞和空载体转染细胞作对照;在经G418筛选后,以荧光显微成像技术观察细胞的转染效果,以蛋白印迹法分析转染后细胞中的DNA聚合酶β表达情况。结果在转染重组子的细胞中,DNA聚合酶β的表达明显下调,仅相当于正常细胞的17·3%。结论人支气管上皮细胞DNA聚合酶β基因的靶向抑制成功。

中国生育男性DNA聚合酶γ基因CAG三核苷酸重复及与特发性男性不育的相关性研究

目的:分析中国特发性男性不育患者与正常男性DNA聚合酶γ(Polg)基因CAG三核苷酸重复,探讨CAG三核苷酸重复序列多态性与男性不育的关系。方法:应用PCR结合基因扫描(GeneScan)分型技术,对104例正常对照与55例弱精子症患者、57例少精子症患者、34例无精子症患者进行Polg基因分型。结果:弱精子症患者10/not10基因型比例大于其他各组,但统计学分析差异无显著性。结论:首次提示Polg基因CAG三核苷酸重复数目在欧洲和中国正常男性中可能存在人种差异,而10/not10基因型与精子运动障碍的关系需进一步研究。

DNA修复酶基因多态性与食管癌易感性的关系

癌症的形成不但与癌基因激活、抑癌基因失活、代谢酶基因异常等有关,而且与修复酶基因异常也有重要关系。目前许多研究致力于寻找食管癌的易感基因,从而阐明食管癌的遗传易感性及癌变机制。本文就食管癌相关DNA修复基因的研究现状作一综述。

家蚕核型多角体病毒编码miR-364对DNA聚合酶基因表达的调控作用研究

MicroRNA(miRNA)在调控病毒与宿主相互作用方面起着重要作用。为了研究家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)编码的miRNA对其自身靶基因的调控作用,通过高通量测序得到Bm NPV编码的一条miRNA——Bm NPV-miR-364,利用在线靶基因预测程序RNAhybrid与RNA22预测Bm NPV基因组中有6个基因可能是Bm NPV-miR-364的靶基因。分别构建Bm NPVmiR-364与6个侯选靶基因3'-UTR的表达载体,共转染Bm N细胞后检测其双荧光素酶活性,结果表明Bm NPV-miR-364对Bm NPV DNA聚合酶(DNA polymerase)基因的抑制作用显著(P<0.05),对其余5个靶基因的抑制作用不显著。进一步采用Bm NPV-miR-364 mimic与Bm NPV-miR-364 inhibitor分别进行过表达和缺失表达分析,显示Bm NPV-miR-364 mimic能显著抑制DNA polymerase基因的表达,而Bm NPV-miR-364 inhibitor能显著解除Bm NPV-miR-364对DNA polymerase基因的抑制作用。将Bm NPV-miR-364与DNA polymerase基因的表达载体共转染Bm N细胞,qRT-PCR分析发现实验组细胞中病毒DNA polymerase基因的表达水平显著低于对照组。qRT-PCR检测家蚕经口接种Bm NPV后24 h内,血淋巴中Bm NPV-miR-364和病毒DNA polymerase基因的表达量很低,但在24 h之后表达量急剧上升。研究结果提示:Bm NPV编码的miR-364可以靶向抑制自身复制过程中的重要酶基因,调节DNA的复制。

茶树DNA甲基转移酶基因CsDRM2的克隆及表达分析

DNA甲基化作为表观遗传修饰的主要途径之一,能够通过对基因组DNA的修饰参与植物对外界环境胁迫的响应,DNA甲基化需要DNA甲基转移酶的参与。实验室前期研究表明,茶树在冷驯化过程中发生了甲基化反应。通过RACE克隆,获得了茶树中DNA甲基转移酶Cs DRM2基因的c DNA全长序列(NCBI登录号KR057963)。Cs DRM2序列全长2328bp,含1815bp的开放阅读框,编码604个氨基酸,预测蛋白质分子量为67.39 k D,理论等电点(PI)为4.85。生物信息学分析结果显示,茶树Cs DRM2蛋白与芝麻和烟草的亲缘关系最近,Cs DRM2的氨基酸序列与其他植物的DRM2相似性均高于65%。Cs DRM2基因表达分析的结果发现,随着冷驯化的进行,Cs DRM2基因的表达量呈现出增加的趋势,参与茶树冷驯化过程的甲基化响应。

桃ACC合酶基因组DNA(pACSG01)的序列分析及其表达

以桃基因组DNA为模板 ,用套式PCR技术扩增并克隆了桃ACC合酶基因片段 ,将其克隆 (定名为pACSG0 1)并进行序列测定 ,表明该片段全长 132 0bp ,并富含HindⅢ和EcoRI位点 ,与其它ACC合酶基因结构序列有一定的相似性 ,内含两个内含子 ,编码的氨基酸序列与已克隆桃ACC合酶cDNA推导的氨基酸序列的同源性分别为 5 7.4%和5 6 .8%.pACSG0 1与我们已克隆的两个桃ACC合酶cDNA基因表达有所不同 ,RNA点杂交和RT -PCR结合Southern杂交分析表明 ,该基因在成熟和乙烯处理的果实均不表达 ,伤处理、LiCl和生长素处理也不能诱导该基因的表达 ,在衰老花瓣中也不表达 .图 3参

不同致病型马立克氏病病毒DNA聚合酶基因序列比较

为了分析马立克氏病病毒(MDV)致病型与其DNA聚合酶基因的关系,本研究比较了9个不同致病型的该基因的同源性关系,这包括四种不同致病型的国际参考株即弱毒疫苗株CVI988/Ripens株、强毒株GA、超强毒株Md5和特超强毒株648A;中国疫苗株814、中国强毒参考株.Jing-1及3个中国野毒株.结果表明:MDV的DNA聚合酶基因非常保守,在比较的9个毒株间,该基因上游约369个碱基的调控序列的同源性在96.7%～100%之间,该基因编码的1220个氨基酸序列的同源性在99.2%～100%之间.尽管不同毒株在一些位点上出现了氨基酸的变异,但这些变异与病毒的致病型或地域分布没有明显的关系.

DNA聚合酶基因在共济失调毛细血管扩张症家系突变状态的研究

目的通过对一个基因损伤修复缺陷性疾病共济失调毛细血管扩张症(AT)家系DNA聚合酶基因突变分析,初步观察其稳定突变位点,为上述疾病易感基因风险突变位点的进一步确定奠定基础。方法对该家系先征者DNA聚合酶基因家族,polA、polB、polD1、polD2、polE1、polG测序,检测突变位点,分析并筛选有意义突变位点;对该家系成员在先征者有意义突变区域直接测序。结果 AT家系患儿DNA聚合酶基因无外显子突变,但在polE1 12p24.3 132696619A>G,该突变位置处于该基因的3′UTR下游;家系中患儿的母亲、外祖母及舅舅发生12p24.3 132696619A>G。结论 AT家系先证者在DNA聚合酶基因外显子没有检测到突变位点,但在3′UTR位置检测到一个有意义突变位点,在家系成员中亦有突变,其可能为AT疾病的稳定突变位点。

DNA聚合酶基因在范可泥贫血症家系突变状态中的影响研究

目的通过对范可泥贫血症(fanconi anemia,FA)家系DNA聚合酶基因突变分析,初步观察其稳定突变位点,为上述疾病易感基因风险突变位点的进一步确定奠定基础。方法 FA家系15例成员作为研究对象对家系先征者DNA聚合酶基因家族POLA、POLB、POLD1、POLD2、POLE、POLG测序,检测突变位点,并分析筛选有义突变位点;对家系成员在先征者有义突变区域直接测序。结果 FA患儿DNA聚合酶的外显子共有四个突变位点。其中,POLD1 19p13.3-1 3.4 EXON2 50403975 G>A,密码子由CGU变为CAU,氨基酸由精氨酸变为组氨酸;POLE1 12p24.3EXON43-44 132688389 A>G,密码子由GAG变为GGG,编码氨基酸由谷氨酸变为甘氨酸;家系中患儿的母亲、外祖父发生POLD1 EXON2 50403975 G>A;家系中患儿的外祖母、外祖父、祖母、父亲、母亲、二伯、四伯、大姑、二姑、两个堂姐均发生了POLE1 EXON43-44 132688389 A>G。结论通过对FA家系成员在上述已经筛选出的两个突变位点进行测序,该家族成员广泛携带这两个突变位点。这两个基因的突变位点应得到足够的重视,其可能为FA疾病的稳定突变位点。

siRNA干扰HSV-1 UL30 DNA聚合酶基因的研究

目的:筛选高效沉默HSV-1UL30基因的siRNA,研究siRNA沉默UL30基因后对HSV-1繁殖的影响。方法:设计并化学合成12对靶向UL30基因的siRNA,与pEGFP-N1-Fi融合表达质粒共转染VERO细胞,流式细胞术筛选高效抑制Fi-EGFP融合蛋白的siRNA,实时荧光定量PCR检测siRNA对感染细胞内UL30mRNA表达的抑制效果,CPE法和空斑减数实验评价siRNA对HSV-1繁殖的抑制效果。结果:共转染实验筛选出高效抑制Fi-EGFP融合蛋白的siRNA4、siRNA10及siRNA8,这3对siRNA均能显著降低感染细胞内UL30mRNA的表达水平及病变细胞释放到培养上清的子代病毒滴度,siRNA4和siRNA10在感染后36h对HSV-1的繁殖有明显的抑制效果,其病斑分别比对照组减少61.17%、51.46%(P<0.05),siRNA4、siRNA10及siRNA8组最终形成的空斑直径分别比对照组减小29.94%、23.49%、21.69%(P<0.01)。结论:筛选到高效抑制UL30的3对siRNAs,siRNA4及siRNA10在病斑形成早期对HSV-1的繁殖有明显的抑制效果,说明siRNA4、siRNA10及siRNA8均能延缓病斑的扩大和病斑数目的增长,对病毒的繁殖有一定的抑制效果。

食管癌细胞分化过程中DNA聚合酶ι基因的表达研究

研究食管癌细胞分化过程中DNA聚合酶ι基因的表达。方法:回顾性选取2019年6月-2021年10月包头市某医院食管癌根治术后辅助放疗患者100例,依据DNA聚合酶ι基因(Pol ι)表达分为Pol ι低表达组(20例)、Pol ι高表达组(80例)两组。分析Pol ι表达与临床病理特征的相关性,并COX比例风险回归模型分析食管癌术后辅助放疗预后受到Pol ι的影响。结果:Pol ι低表达组和Pol ι高表达组患者的性别、年龄、病理分级、TNM分期、T分期、N分期之间的差异均不显著(P>0.05)。COX比例风险回归模型分析显示,食管癌术后辅助放疗预后的影响因素包括N分期、Pol ι表达(P0.05),不包括性别、年龄、T分期(P>0.05)。结论:食管癌细胞分化过程中DNA聚合酶ι基因的表达提升,影响食管癌术后辅助放疗预后。

染色质解旋酶/ATP酶的DNA结合蛋白1样基因致瘤机制研究进展

染色质解旋酶/ATP酶的DNA结合蛋白1样基因(CHD1L)是一种新近被证实与在许多实体瘤中表达增多的致癌基因,它定位于第1号染色体q21区。CHD1L在肝细胞癌和其他肿瘤中的功能性研究提示,该基因在肿瘤形成过程中可以引起细胞增殖、调节G1/S过渡期并且可以抑制细胞凋亡。CHD1L活化的潜在机制可能是通过结合凋亡蛋白Nur77,或通过上调CHD1L调控的靶基因(如ARHGEF9、SPOCK1或TCTP)受体以激活蛋白激酶B通路,从而干扰细胞死亡程序。CHD1L目前已经被认为是一种新的可独立评价一些实体性肿瘤进展、预后以及生存率的生物标志物。现有的对CHD1L的认识在将来也许可以激励大家进行对一些特定肿瘤的靶向治疗研究。

DNA聚合酶δ催化亚基基因在三阴性乳腺癌组织中的表达及其与预后的关系研究

目的观察三阴性乳腺癌组织与对应癌旁组织中DNA聚合酶δ催化亚基基因(POLD1)的表达及其与预后的相关性。方法采用荧光定量PCR及免疫组织化学的方法检测110例三阴性乳腺癌患者癌组织标本及其对应的癌旁正常组织标本中POLD1蛋白的表达情况。分析POLD1蛋白的差异表达与患者临床病理特征及与预后的关系。结果110例癌组织中POLD1表达阳性81例(73.6%),阴性29例(26.4%)。癌旁组织中,POLD1表达阳性24例(21.8%),阴性86例(78.2%)。POLD1在癌组织中表达阳性率明显高于癌旁正常组织(χ^2=59.195,P<0.001)。POLD1的表达与组织学分级、TNM分期和淋巴结转移有关(P=0.002、0.010和0.018),与年龄、肿瘤大小、Ki-67标记指数、p53和表皮生长因子受体表达等无关。采用Kaplan-Meier法分析总生存期和无进展生存期,POLD1高表达组患者的无进展生存期明显短于POLD1低表达组(P=0.038),总生存期与POLD1低表达组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Cox回归分析结果显示,POLD1表达、TNM分期、淋巴结转移是影响三阴性乳腺癌患者无进展生存期的独立危险因素(风险比=0.380,95%置信区间:0.147~0.985;风险比=4.816,95%置信区间:1.856~12.496;风险比=2.810,95%置信区间:1.435~5.506;均P<0.05)。结论POLD1蛋白的高表达提示三阴性乳腺癌较差的临床预后。

沉默羊传染性脓疱皮炎病毒DNA聚合酶基因的RNAi载体的构建

为了构建用于沉默羊传染性脓疱皮炎病毒(Orf virus,ORFV)DNA聚合酶基因的2种载体,试验选择病毒复制所必需的DNA聚合酶基因作为干扰靶基因,并设计靶基因的扩增引物,经PCR扩增后测序;随后,与Check2载体分别经PmeⅠ和NotⅠ双酶切,酶切后连接产生Check2-靶基因(Check2-D)重组质粒;然后,利用公用网站按照RNAi序列设计的原则,设计RNAi靶点序列并合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经XhoⅠ和HpaⅠ酶切后的pll3.7载体连接产生pll3.7-shRNA质粒;最后,利用磷酸钙法进行pll3.7-shRNA质粒和Check2-D质粒共转染293T细胞,利用双荧光检测系统试剂盒检测其RNA干扰效果。结果表明:成功构建了pll3.7-shRNA质粒和Check2-靶基因重组质粒,干扰效果最好,可达到91.0%。

17α-甲基睾酮对稀有鮈鲫精巢DNA甲基转移酶基因表达的影响

[目的]以稀有鮈鲫雄鱼为研究对象,探讨17α-甲基睾酮(17α-methyltestosterone,MT)对稀有鮈鲫精巢甲基转移酶(DNMT)基因相对表达量的影响。[方法]采用不同浓度MT(25、50和100 ng/L)处理稀有鮈鲫雄鱼7、14和21 d,处理结束时,每组随机解剖10条鱼,取精巢组织,Trizol一步法提取总RNA,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测DNA甲基转移酶基因(dnmts)相对表达量。[结果]MT处理稀有鮈鲫雄鱼7 d,25 ng/L MT处理组(P<0.05)、50 ng/L MT处理组(P<0.01)和100 ng/L MT处理组(P<0.05)精巢dnmt3基因相对表达量显著(或极显著)降低;25 ng/L MT处理组和50 ng/L MT处理组精巢dnmt5基因相对表达量显著(P<0.05)降低;50 ng/L MT处理组精巢dnmt7基因相对表达量显著(P<0.05)降低。MT处理稀有鮈鲫雄鱼14 d,100 ng/L的MT处理组dnmt3、dnmt5、dnmt6、dnmt7基因相对表达量显著(P<0.05)升高;50 ng/L的MT处理组dnmt1基因相对表达量极显著(P<0.01)升高。MT处理稀有鮈鲫雄鱼21 d,50 ng/L MT处理组和100 ng/L MT处理组dnmt1基因相对表达量显著(P<0.05)升高;100 ng/L MT处理组dnmt8基因相对表达量极显著(P<0.01)升高。[结论]MT可以干扰稀有鮈鲫精巢DNA甲基转移酶基因dmmts的mRNA表达。MT对DNMTs酶活性的影响以及是否可以通过改变DNA甲基化水平对稀有鮈鲫精子的发生产生影响有待研究。

DNA聚合酶β基因在眼睑基底细胞癌中的表达及意义

目的探讨DNA聚合酶β基因在眼睑基底细胞癌中的表达及意义。方法收集30例眼睑基底细胞癌及30例癌旁正常眼睑组织为研究对象,RT-PCR、荧光定量PCR技术检测标本中Polβ聚合酶基因的表达差异,western blot技术检测标本中Polβ聚合酶在蛋白水平的表达差异;对正常眼睑组织及眼睑基底细胞癌组织中Polβ基因的表达进行统计学分析。结果荧光定量和western blot结果显示,30例正常眼睑组织中仅有5例Polβ基因呈高水平表达,其余25例低水平表达;30例眼睑基底细胞癌标本中,9例早期眼睑基底细胞癌中6例呈高水平表达,3例低水平表达;21例浸润性眼睑基底细胞癌组织中有16例呈高水平表达,5例呈低水平表达。Polβ基因在正常眼睑组织中的表达低于在眼睑基底细胞癌组织中的表达,有显著性差异(P<0.05)。结论 Polβ基因在眼睑基底细胞癌组织中的表达明显高于正常对照,提示Polβ基因以高水平表达的方式参与眼睑基底细胞癌的发生发展过程。在眼睑基底细胞癌发生的早期即可发现Polβ基因的高表达,提示其可以作为癌变的一个早期诊断标准。

基于BmNPV DNA聚合酶基因对昆虫杆状病毒系统进化的分析

将家蚕核型多角体病毒DNA聚合酶基因与2009年3月前完成全基因组测序的49种杆状病毒DNA聚合酶基因进行核苷酸序列和氨基酸序列的同源性比较分析,并建立基于氨基酸序列的系统进化树。结果显示,该系统进化树支持将杆状病毒分为鳞翅目核型多角体病毒、鳞翅目颗粒体病毒、膜翅目杆状病毒和双翅目杆状病毒的最新建议分类系统,且BmNPV与其他大多数核型多角体病毒同源性较高,属于鳞翅目Group I NPVs,与AcMNPV、PlxyNPV亲缘关系最近。

杆状病毒介导的靶向DNA甲基转移酶1 siRNA表达载体的构建

目的:构建携带DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)RNAi基因的重组杆状病毒载体,以进一步研究DNMT1对胰腺癌相关基因的影响。方法:首先将带有BglⅡ和HindⅢ酶切黏性末端的60 bp正义和反义寡核苷酸退火,与用BglⅡ和HindⅢ双酶切后的线性化载体pSUPER连接构建成pSUPER si-DNMT1-D,然后将H1启动子和RNAi序列从上述重组载体切下,插入至同样双酶切的pFastBac1载体,经过转座重组,抽提重组BacmidDNA,转染草地贪夜蛾细胞Sf9,获得重组杆状病毒Bac-si-DNMT1-D。将上述重组杆状病毒感染胰腺癌PaTu8988细胞系,其中以重组杆状病毒r-Bac-CMV-EGFP作为阴性对照。然后运用荧光定量PCR检测DNMT1基因表达变化。结果:重组杆状病毒能够感染PaTu8988细胞,并且能显著干扰DNMT1基因表达。结论:杆状病毒表达系统可以作为RNAi载体,为以后的基因治疗开辟新的途径。