重叠延伸PCR生成长重复DNA序列及其在纳米孔测序中的应用

短链DNA的纳米孔测序存在孔道利用率低、数据质量差等问题。因此,亟需建立一种用纳米孔测序技术准确测定短链DNA序列的方法。本研究以1 nmol/L完全互补的序列为引物,以短链DNA为模板,在72℃退火温度下进行PCR,实现了短链DNA的重叠延伸,最终生成长串联重复序列,其产物长度为原始长度的5~20倍。生成的长链DNA可直接测序,仅需对齐单个或少数几个Reads进行简单分析即可获得精确的序列信息。本研究所开发的重叠延伸法将纳米孔One read精确度提高至99.28%,这对提高纳米孔测序的精度具有重要作用。

烧伤病房耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的DNA重复序列PCR研究

目的 研究烧伤病房耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (methicillin-resistantStaphylococcusaureus ,MRSA)的分布及传播 ,探讨烧伤病房医院感染的预防、监测及控制工作。 方法 采集烧伤患者的创面、鼻前庭 ,工作人员手、鼻前庭 ,陪护家属的手、鼻前庭及烧伤科病房各种环境表面共5 0 4份标本 ,从中分离到MRSA 5 8株 ,对苯唑西林敏感的金黄色葡萄球菌 43株 ,并对所分离的MR SA菌株的基因组DNA进行重复序列PCR检测。 结果 5 3.7% (2 2 / 41)的患者创面分离出MR SA ,其中 5例鼻前庭分离出MRSA ;19名工作人员中 ,3人手分离出MRSA ,工作人员鼻前庭未分离到MRSA ;43例患者陪护家属中有 9人手上分离出MRSA ,2人鼻前庭分离出MRSA ;193份环境标本共分离MRSA 13株。通过MRSA细菌基因组DNA重复序列PCR分析 ,发现部分患者创面之间及创面与工作人员、陪护和环境之间存在MRSA同源株。 结论 (1)MRSA在烧伤科分布广 ,其中不乏同源株 ;(2 )基因组DNA重复序列PCR分析 ,显示烧伤病室存在两例患者之间的交叉感染 ,MRSA在烧伤病房的传染源为患者 ,传播途径与陪护及工作人员的手污染有关 ;(3)MRSA的广泛存在 ,携带率高 ,手与环境的污染 。

通过PCR技术简单扩增奶牛高GC含量的rDNA重复序列

为了探索利用PCR简单扩增高GC含量的长重复序列的方法,经反复摸索后选用LAPCR法即LAPCRTaq酶结合GC缓冲液Ⅱ来扩增奶牛高GC含量的长片段重复序列,成功获得了全长2538bp,GC含量为65.7%的DNA序列,其中ITS1的GC含量高达80%.探索了克隆复杂DNA序列时引物设计的特别规则、反应体系的改进、DNA聚合酶的选用等措施.

一种检测端粒DNA重复序列相对长度的新方法—PCR法

目的 :为了观察补肾益精方药对端粒DNA重复序列长度的影响 ,创建一种新的简便的测定端粒DNA重复序列相对长度的方法。方法 :其原理是端粒DNA重复序列越长 ,其扩增产物越多 ,反之就少。根据端粒DNA重复序列 ,设计合成特殊的引物 ,引物 1为 5′CCCTAA3′ ,引物 2为 5′ ,TTAGGG3′ ,同时使用Taq和PfuDNA聚合酶 ,对端粒DNA重复序列进行PCR扩增。结果 :琼脂糖凝胶电泳结果表明 ,端粒DNA重复序列得到扩增 ,λDNA对照没有扩增。结论 :端粒DNA重复序列确实得到了扩增 ,创建的此方法获得了成功。

应用正交实验法优化DNA重复序列的PCR扩增体系

采用L9(34)正交实验法,对与人神经系统疾病相关的DNA重复序列PCR扩增体系中的模板DNA浓度、Taq酶浓度、引物浓度、dNTP浓度4种影响因素进行了优化筛选,发现引物浓度对扩增结果影响的显著性最大.在此基础上进行了引物浓度单因素实验,得到最优DNA重复序列PCR扩增体系在25μL反应体系中各组分的最适浓度分别为:模板3 ng/μL、Taq酶0.75 U、dNTP0.25 mmol/L、引物0.3μmol/L.通过优化前后反应体系的对比,扩增目的产物的量均有较大程度的提高.该优化体系的建立为进一步研究与人遗传病相关的DNA重复序列的结构特性及阐明该类遗传疾病的分子机理奠定了基础.

用重复序列引物PCR分析不同滞育状态麦红吸浆虫DNA多态性

应用5个重复序列引物，通过PCR扩增试验，研究了不同滞育状态麦红吸浆虫DNA的多态性。结果表明：1）5个重复序列引物共扩增了104条核酸带，分子量介于202—1163bp之间；2）不同滞育状态的麦红吸浆虫的平均相似性指数范围在0．573～0．936之间，在种群3和种群4之间，最大的平均相似性指数是0．936，在种群1、3、4、5和种群6、7、8之间平均相似性指数较高（均超过0．81）；3）不同滞育状态麦红吸浆虫群体的遗传变异大部分来自群体间，产生于群体间的变异为62．41％，来自群体内的变异为37．59％；4）根据对不同滞育状态间遗传距离的聚类分析，麦红吸浆虫的滞育类型可分为三大类。首次报道了不同滞育状态麦红吸浆虫量化的DNA多态性。

人单拷贝及重复DNA序列的原位PCR

在培养的人小肠癌转移腹水细胞系细胞中进行了Y染色体特异的重复序列及单拷贝序列的原位扩增与检测 .结果显示原位PCR法的灵敏度比直接的原位杂交法明显提高 .

反向重复序列DNA的PCR扩增特性研究

旨在研究反向重复序列形成的发卡结构对模板扩增的影响。研究DNA发卡结构中环部大小、茎部长度、引物相对于茎部位置等对PCR扩增效率的影响,探讨如何通过引物设计及改变退火温度等条件来实现发卡结构DNA的有效扩增的方法。结果显示,如果引物的位置同发卡结构茎部5'序列相同或部分相同,则由于发卡结构的形成阻碍引物与模板结合而对PCR产生抑制作用,并且抑制作用随着茎部长度的增加而增强;当环部的长度达到50 nt以上时,抑制作用明显减弱。较高的退火温度和引物浓度都有助于引物同分子内形成发卡结构的竞争,使PCR扩增更容易进行。

PCR检测结核分枝杆菌复合群IS_(986)DNA重复序列

用ＰＣＲ检测ＭＴＢＣ特异的ＩＳ９８６ＤＮＡ重复序列。ＩＳ９８６ＤＮＡ重复序列全长１３５８ｂｐ，特异地存在于ＭＴＢＣ细菌染色体ＤＮＡ中，并且多次重复出现。作者参照文献，在此序列内合成一对引物，扩增出１８８ｂｐ的ＭＴＢＣ特异的ＤＮＡ片段。实验证明具有高度的特异性和敏感性。与其它的分枝杆菌和人血细胞ＤＮＡ无交叉反应。最小检出极限为１０ｆｇＤＮＡ或１０个菌体／ｍｌ。对ＰＣＲ反应体系中有关实验条件如引物浓度、ＴａｑＤＮＡ聚合酶用量、循环程序等进行了优化选择。在临床标本细菌ＤＮＡ抽提中首次采用了简便的ＴＥ－Ｔｒｉｔｏｎ煮沸法，节省了成本，使整个检测时间缩短至６～８ｈ。

中国弓形虫虫株529bp重复序列的PCR扩增、克隆及分析

【目的】首次对中国来源于不同宿主、不同地域的9个弓形虫虫株(ZS1人株、PY猪株、GY猪株、ZC猪株、NT猪株、ZS人株、SH人株、CN猪株、QHO绵羊株)以及国际标准强毒RH株之间在529bp重复序列的变异进行研究,从而为进一步的分子诊断和分子遗传学研究以及弓形虫病的防制奠定基础。【方法】抽提基因组DNA后,用PCR方法对10个虫株的529bp重复序列进行扩增;扩增产物经纯化后克隆于pGEM-TEasy质粒载体,再经菌落PCR及酶切鉴定阳性克隆,然后对阳性克隆进行测序及序列分析。【结果】10个弓形虫虫株的529bp重复序列都不完全相同,它们之间的核苷酸序列变异范围为0.8%～2.9%。变异主要位于第32～55位碱基之间,这些碱基变异与虫株的宿主来源、地域来源及毒力之间没有相关性。【结论】529bp重复序列可作为遗传标记,用于弓形虫与其它寄生虫的种间鉴定,但不适合用于研究弓形虫的种内遗传变异。

鹿源类中药材DNA序列分析及马鹿和梅花鹿的PCR鉴定

目的采用特异引物PCR扩增鉴定马鹿和梅花鹿源中药材。方法从马鹿、梅花鹿等国内11种鹿的鹿血和鹿茸中提取DNA,用通用引物L1091和H1478调取细胞线粒体12SrRNA基因片段,在该片段核苷酸序列比对的基础上,设计马鹿和梅花鹿高特异性PCR鉴定引物对,并进行PCR特异性鉴定。结果12SrRNA基因片段能较好地在种的水平上将不同的种区分开来;特异引物对(EP-1/H1478和EP-2/H1478)PCR可准确地鉴定出马鹿和梅花鹿等。结论特异引物PCR适宜马鹿、梅花鹿等珍贵中药材的鉴定。

孕妇血浆中游离胎儿DNA短串联重复序列检测

目的:建立一种简便、不依赖于胎儿性别和父本DNA的无创性产前诊断方法。方法:应用降落PCR和二次PCR扩增技术,结合母源DNA对照,以34例孕妇外周静脉血血浆作为标本,口腔上皮细胞拭子作为母源对照,孕妇配偶外周血DNA作为父源对照,检测正常孕妇血浆中游离胎儿DNAD17S1293、D21S11及DXS8377等基因位点。结果:34例孕妇血浆DNA中均检出非母源性等位基因条带,其中17例经父源DNA验证。结论:采用降落PCR和二次PCR扩增技术,可以提高孕早期微量游离胎儿DNA的扩增效率,准确、快捷地获得不依赖于父本DNA的胎儿遗传信息。

细菌基因组重复序列PCR技术及其应用

细菌中散在分布的DNA重复序列近年来不断被报道,基因外重复回文序列和肠细菌基因间共有重复序列是两个典型的原核细胞基因组散在重复序列。重复序列在染色体上的分布和拷贝数具种间特异性,用它们的互补序列作为引物,以细菌基因组DNA为模板进行PCR扩增反应,反应产物的琼脂糖电泳可以提供非常清晰的DNA指纹图谱,使用此图谱既可对各种微生物进行快速分型及鉴定,又可对它们进行DNA水平上的遗传多样性分析。细菌基因组重复序列PCR技术具有简捷、快速、结果稳定等特点,可对细菌进行分子标记,用于菌株分型、分类鉴定和亲缘关系等方面的研究。

绵羊线粒体DNA D-loop区串联重复序列变异研究(英文)

对来自69个我国地方绵羊品种和8个国外引入品种共计77个个体线粒体DNA控制区长度为75bp的串联重复序列进行了测序分析。在309个重复序列中检测到28个变异位点,其中7个为具有2个变异体的单现突变,1个为具有3个变异体的单现突变,20个为具有2个变异体的简约位点。由28个变异位点中归纳出63个单倍型,其中单倍型Ⅰ和单倍型Ⅲ具有较高的比例,分别为12.94%和30.42%。研究结果揭示我国地方绵羊可能起源于两个母系祖先。哈萨克羊和阿勒泰羊间以及蒙古羊和乌珠穆沁羊间分别具有较近的亲缘关系且没有明显的遗传分化。藏绵羊、蒙古羊和乌珠穆沁羊相对哈萨克羊和阿勒泰羊而言具有较低的遗传多样性。

日本血吸虫中国大陆株雌性特异性DNA片段及重复序列的分离与鉴定

目的 分离鉴定日本血吸虫基因组 DNA的雌性特异性片段及 DNA重复序列。方法 分别提取雌、雄日本血吸虫基因组 DNA ,制备检测子和驱动子 ;利用代表性差异分析 (RDA)及 PCR进行扣除杂交 ,获得目的 DNA片段 ;对所获目的 DNA片段用低熔点凝胶回收 ;转质粒载体、重组质粒载体的阳性克隆筛选、测序 ;用 Southern blotting对目的 DNA片段进行鉴定。结果 RDA及 PCR获得 5个目的 DNA片段 ;并转质粒载体测定了 5个目的 DNA片段 (P1～ P5 )的序列。 Southern blotting显示 DNA片段 P1和 P2均与雌、雄基因组 DNA强烈杂交 ;DNA片段 P3与雌性基因组 DNA的杂交强度明显高于与雄性基因组 DNA的杂交强度 ;DNA片段 P4和 P5仅与雌性基因组 DNA杂交 ,但不与雄性基因组 DNA杂交。结论 DNA片段 P1和 P2为日本血吸虫 DNA重复序列 ,并以多拷贝存在于日本血吸虫基因组 DNA中 ;DNA片段 P3存在于日本血吸虫性染色体 W和 Z上 ,在性染色体 W的拷贝数多于在性染色体 Z上的拷贝数 ;DNA片段 P4和 P5仅存在于日本血吸虫性染色体 W上 ,为日本血吸虫雌性特异性片段。

利用重复序列引物PCR方法对棉蚜地理种群遗传差异的初步研究

用 3个重复序列作为引物进行PCR ,对棉蚜同一地区种群以及不同地区种群同时进行DNA多态性分析 ,结果表明同地区群体内的棉蚜DNA多态性明显小于不同地区间群体。这样 ,就验证了棉蚜种群分化的相关理论 ,以及重复序列引物PCR这种方法的可靠性 ,同时也为用重复序列引物PCR这种方法来对中国不同地域棉蚜种群遗传分化进行后续研究奠定了基础。

微量DNA的短串联重复序列分型可行性

目的了解微量DNA分型的法医学应用的可行性。方法一系列浓度的DNA模板用PowerPlexTM16System试剂盒扩增,并用ABI377DNA测序仪进行短串联重复序列(STR)的分型。结果当模板量小于250pg时,部分位点发生了等位基因漏扩,并出现非特异带、杂合子扩增不平衡等干扰分型的杂峰。结论上述这些不正常的现象可能会导致分型错误。在对微量检材的DNA检验结果进行判型时一定要小心谨慎,全面考虑。

不同冬夏寄主棉蚜种群重复序列引物DNA多态性分析

应用重复序列引物PCR技术研究了中国不同冬夏寄主上棉蚜种群的DNA多态性 ,通过筛选出的 3种适用于棉蚜的重复序列引物 ,用它们的扩增结果进行相似性指数Is和Nei’s遗传距离D的计算 ,并根据遗传距离对所研究的棉蚜种群做聚类分析 ,结果表明 ,用遗传距离指标可以将冬夏寄主上的棉蚜分开 ,并且在不同的冬寄主之间 ,较适宜越冬的不同寄主上的棉蚜呈现出更大的相似性 .在实验数据的分析过程中 ,还发现遗传距离指标比相似性指数Is具有更大的客观性和严谨性 ,是一种十分理想的遗传差异分析指标 .图 4表 5参

利什曼原虫—DNA重复序列在虫种鉴定上的价值分析

目的 通过分析和比较我国利什曼原虫分离株与相应的利什曼原虫世界卫生组织(WHO)参照株在一种DNA重复序列上的同源性以考察这一DNA重复序列应用于鉴别我国利什曼原虫的价值。方法 PCR扩增各利什曼原虫分离株的DNA重复序列片段并测序,用GENEDOC软件比较扩增的各分离株DNA重复序列的同源性。结果 该DNA重复序列在种内各利什曼原虫分离株间完全同源或高度同源(99%～10 0 % ) ,且碱基变异具有高度稳定性,而在种间则显示相当的差异(一般同源性小于90 % )。结论 该DNA重复序列在我国利什曼原虫的鉴定上有较好的实用价值。