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一种基于HDR-CRISPR/Cas9技术快速构建重组鸭肠炎病毒的方法的建立
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作者 贾文凤 蒋香香 +3 位作者 陶慧丽 王安平 吴植 朱善元 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第1期298-309,共12页
[目的]本研究通过优化试验条件,建立基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速、准确地将外源基因定向插入鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus, DEV)基因组的方法,为以DEV为载体的重组疫苗的研制奠定基础。[方法]分离并扩繁DEV疫苗株,测定其... [目的]本研究通过优化试验条件,建立基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速、准确地将外源基因定向插入鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus, DEV)基因组的方法,为以DEV为载体的重组疫苗的研制奠定基础。[方法]分离并扩繁DEV疫苗株,测定其病毒滴度。根据DEV疫苗株UL26、UL27基因间非编码区序列,设计合成向导RNA(gRNA),经双链退火获得目的片段,通过基因克隆技术将其插入PX459-V2.0载体获得gRNA-Cas9质粒。同时,通过常规基因克隆技术将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因插入PVAX-1载体,构建含有真核表达盒P_(CMV)-EGFP-BGH pA的重组表达质粒。以DEV疫苗株基因组为模板,扩增gRNA上、下游同源臂序列,通过融合PCR将同源臂序列与真核表达盒P_(CMV)-EGFP-BGH pA进行连接并克隆至PUC19载体获得供体质粒PUC19-UP-EGFP-DOWN。采用先转染质粒后感染亲本DEV的策略构建重组病毒rDEV-EGFP,通过控制单一变量法优化重组病毒构建的试验条件,根据不同条件下绿色荧光蚀斑数量确定最佳条件。利用有限稀释法筛选并纯化表达绿色荧光的蚀斑,获得重组病毒rDEV-EGFP,并对其进行遗传稳定性及体外复制能力的评估。[结果]PCR扩增及测序结果显示,成功构建靶向DEV基因组UL27与UL26基因间非编码区序列的gRNA-Cas9质粒及包含EGFP真核表达盒的供体质粒。鸡胚成纤维细胞(chick embryo fibroblast, CEF)中转染gRNA-Cas9及供体质粒后感染DEV,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光蚀斑,表明成功利用HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术将EGFP报告基因敲入DEV基因组。优化后的最佳试验条件为:DEV感染复数(MOI)为0.2、gRNA-Cas9质粒与供体DNA转染比例为1∶2、供体DNA的转染形式为DNA片段、转染与感染时间间隔为6 h、重组病毒收取时间为DEV感染后48 h,优化后EGFP报告基因的敲入效率显著提高(P<0.05)。重组病毒rDEV-EGFP在CEF中连续传代15次,EGFP真核表达盒仍稳定整合在UL26与UL27基因之间的非编码区,具有良好的遗传稳定性。生长曲线结果显示,重组病毒rDEV-EGFP在CEF中的复制能力与DEV疫苗株无明显差异,生长趋势一致,具有良好的体外复制能力。[结论]本研究建立了一种基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速构建重组DEV的方法,成功构建了具有良好遗传稳定性及体外复制能力的重组病毒rDEV-EGFP,为重组DEV载体疫苗候选株的研制提供了理论依据及技术平台。 展开更多
关键词 鸭肠炎病毒 crispr/Cas9基因编辑 重组载体
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基于CRISPR/Cas系统的免扩增核酸检测技术研究进展
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作者 沈兴 李妍 +5 位作者 张旭 盖作启 刘艳 黄颖茵 雷红涛 陈佳虹 《华南理工大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第1期136-146,共11页
成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)是来源于古细菌的一种免疫系统,可在特定向导RNA的引领下对外来核酸进行识别与切割。由于具有高特异性靶标识别能力以及靶激活的核酸酶活性,近年来该系统被广泛应用于核酸检测领域。为实现高灵敏检测... 成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)是来源于古细菌的一种免疫系统,可在特定向导RNA的引领下对外来核酸进行识别与切割。由于具有高特异性靶标识别能力以及靶激活的核酸酶活性,近年来该系统被广泛应用于核酸检测领域。为实现高灵敏检测,成簇规则间隔短回文重复序列及相关基因编码的系统(CRISPR/Cas)通常需与预扩增技术相结合,但这同时带来了扩增子气溶胶污染、依赖专有设备、检测时间延长等问题。因此,许多研究人员致力于开发免扩增CRISPR核酸检测技术以解决上述限制。CRISPR/Cas靶向激活的高周转率非特异性切割活性为这种技术的开发提供了可能性,利用各种提高系统反式切割效率或者增强信号的策略,许多免扩增CRISPR核酸检测技术被成功开发出来。该文综述了近年开发的基于CRISPR的免扩增核酸检测技术,依据策略不同将这些技术分为Cas效应器的联用或构筑生化回路、电化学传感、微体积CRISPR/Cas系统、优化信号报告物等4个方面,并从策略的角度分析了这些技术实现免扩增核酸检测的原理,即通过累积多个蛋白复合物传导的信号、增强信号传感能力、提高反应体系浓度、放大报告底物信号等原理实现灵敏度提升。基于已有的技术原理,该文对几种策略的优缺点进行讨论。此外,该文进一步展望免扩增CRISPR核酸检测技术的发展趋势并提出未来可能的研究方向,为开发更快速、灵敏、简便的分子检测技术以促进其更深入的应用提供参考。 展开更多
关键词 crispr/Cas 核酸检测 免扩增 信号放大
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CRISPR/Cas9技术(递送)在支气管上皮细胞中的应用和进展
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作者 张莹莹 王楚雯 钱国清 《中国病理生理杂志》 北大核心 2025年第1期173-180,共8页
规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)技术操作简易、高效,适用性强,在探究呼吸道潜在机制中具有独特优势。支气管上皮细胞是肺部防御的物理屏障,其损伤或功能缺失是慢性气道疾病的发病基础。近年来,慢性气道疾病... 规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)技术操作简易、高效,适用性强,在探究呼吸道潜在机制中具有独特优势。支气管上皮细胞是肺部防御的物理屏障,其损伤或功能缺失是慢性气道疾病的发病基础。近年来,慢性气道疾病发病率升高,但治疗进展相对缓慢,亟需找到治疗的突破口。CRISPR/Cas9系统可以进行精准基因编辑,为慢性气道疾病提供新策略。本文从CRISPR/Cas9的多种递送方式和作用机制出发,对其在原代、永生化支气管上皮细胞和动物体内的应用与进展进行概述,探讨了其发展前景和面临的挑战,以期为未来应用该技术进行气道疾病治疗提供参考。 展开更多
关键词 crispr/Cas9系统 支气管上皮细胞 基因编辑
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CRISPR/Cas9技术在子宫内膜癌治疗中的研究进展
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作者 牛译墨 王煜宁 张颐 《现代肿瘤医学》 2025年第2期321-326,共6页
子宫内膜癌(endometrial cancer,EC)是全球第二常见的妇科恶性肿瘤。长期以来,对于患有晚期或复发性子宫内膜癌的患者,传统手术和放化疗治疗效果不甚明显,此为当前需要迫切解决的一大问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术可以通过精确修改基... 子宫内膜癌(endometrial cancer,EC)是全球第二常见的妇科恶性肿瘤。长期以来,对于患有晚期或复发性子宫内膜癌的患者,传统手术和放化疗治疗效果不甚明显,此为当前需要迫切解决的一大问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术可以通过精确修改基因组序列实现诱导基因组插入、缺失或碱基替换等功能,已在探索癌症的发生机制、潜在的治疗靶点以及癌症模型的构建等方面广泛应用,也为子宫内膜癌的临床研究提供了潜在致病靶点和新的治疗方案。该文主要围绕CRISPR/Cas9技术和其近年来在子宫内膜癌的相关研究进展做一综述。旨在为该领域的研究奠定基础,也为子宫内膜癌的临床治疗提供参考。 展开更多
关键词 crispr/Cas9 基因编辑 子宫内膜癌 治疗
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利用CRISPRa技术提高乳酸克鲁维酵母凝乳酶分泌表达
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作者 邓宇慧 王世清 郑艳丽 《湖北大学学报(自然科学版)》 CAS 2025年第1期84-90,共7页
乳酸克鲁维酵母因其可靠的食品安全性被广泛应用于工业酶制剂生产,利用高通量的基因调控技术,如基于CRISPR-dCas9的基因表达激活平台(CRISPR activation,CRISPRa)是进一步促进酶制剂产量提高的最有效方法。本研究将激活因子VPR和LAC9分... 乳酸克鲁维酵母因其可靠的食品安全性被广泛应用于工业酶制剂生产,利用高通量的基因调控技术,如基于CRISPR-dCas9的基因表达激活平台(CRISPR activation,CRISPRa)是进一步促进酶制剂产量提高的最有效方法。本研究将激活因子VPR和LAC9分别与dCas9融合,针对P_(LAC4)启动子上游区域序列设计gRNA,引导dCas9-激活因子融合蛋白对其进行特异性结合,促进RNA聚合酶在该区域的聚集,驱动受P_(LAC4)启动子调控的凝乳酶表达。结果显示,dCas9-VPR与dCas9-LAC9的融合形式可分别将凝乳酶表达量提高1.67倍和1.65倍。本研究为利用乳酸克鲁维酵母进行工业酶制剂生产提供了有效的工具。 展开更多
关键词 乳酸克鲁维酵母 crispr-dCas9 LAC9激活因子 VPR激活因子 凝乳酶
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LAMP-CRISPR/Cas12a技术在重症肺炎病原体检测中的应用
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作者 李玲玲 匡歆 +1 位作者 王贵平 于风格 《检验医学与临床》 2025年第3期415-419,423,共6页
目的分析环介导恒温扩增技术(LAMP)联合CRISPR/Cas12a技术在的重症肺炎病原学检测中的应用效果。方法选取2019年1月至2023年6月青岛市胶州中心医院收治的147例重症肺炎患者作为研究对象,取患者支气管肺泡灌洗液或气管内抽吸物标本进行... 目的分析环介导恒温扩增技术(LAMP)联合CRISPR/Cas12a技术在的重症肺炎病原学检测中的应用效果。方法选取2019年1月至2023年6月青岛市胶州中心医院收治的147例重症肺炎患者作为研究对象,取患者支气管肺泡灌洗液或气管内抽吸物标本进行临床病原学检测、血清学检测及LAMP-CRISPR/Cas12a检测,观察3种方法检测结果,比较LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法与临床病原诊断结果、血清学检查结果一致性。结果147例患者共获得呼吸道标本147份,其中103份为泡灌洗液标本,44份为呼吸道深部痰液。临床病原学检测病原体标本100例,阳性率为68.03%。临床病原学检测结果具体为单一病原体感染85例,混合感染15例;未检测出病原体47例。147例患者中检测免疫球蛋白M抗体,共检出78例,阳性率为53.06%,其中细菌0例,非典型病原体32例,单一病毒感染32例,混合感染例14例,未检测出病原体69例。LAMP-CRISPR/Cas12a检测技术可快速检测重症肺炎病原体。LAMP-CRISPR/Cas12a检测中共检测出病原体标本117例,阳性率为79.59%,其中单纯细菌感染22例,非典型病原体26例,单纯病毒感染51例,混合感染18例,未检测出病原体30例。3种检测方法中,LAMP-CRISPR/Cas12a检测的阳性率最高,血清学检测的结果最低。且LAMP-CRISPR/Cas12a检测的阳性率(79.59%)高于临床病原学检测(68.03%)、血清学检测(53.06%),差异均有统计学意义(χ^(2)=5.085、23.164,P=0.024、<0.001)。在重症肺炎病原体检测中,LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法与临床病原诊断结果、血清学检查结果一致性均较高(Kappa均>0.75,P<0.05)。结论LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法在重症肺炎病原学诊断中的阳性率较高,尤其适用于细菌性重症肺炎与病毒性重症肺炎检测。 展开更多
关键词 重症肺炎 环介导恒温扩增技术 crispr/Cas12a技术 病原学
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Advances in CRISPR-based gene editing technology and its application in nucleic acid detection
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作者 LIUJIE CHEN LILI DUAN +5 位作者 JIA LI JUN CHEN DUANFANG LIAO NONGYUE HE KAI LI ZHENG HU 《BIOCELL》 2025年第1期21-43,共23页
Nucleic acid analysis is a key technique that enables accurate detection of various microorganisms.Conventional nucleic acid testing typically requires access to specialized laboratories,equipment,and trained personne... Nucleic acid analysis is a key technique that enables accurate detection of various microorganisms.Conventional nucleic acid testing typically requires access to specialized laboratories,equipment,and trained personnel,which hinders the widespread use of on-site testing for DNA and RNA targets.However,integrating gene editing technology with traditional nucleic acid detection methods,especially isothermal amplification technology,can help overcome the limitations associated with on-site testing.This combination can accomplish precise and swift detection of nucleic acid sequences,offering a robust tool for on-site detection.The Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins(CRISPR/Cas)technology,which comprises the CRISPR system and Cas effector proteins,is a powerful tool that is advancing the field of nucleic acid detection.Specifically,Cas12,Cas13,and Cas14 proteins have emerged as straightforward,effective,precise,sensitive,and cost-effective methods for in vitro nucleic acid detection because of their“collateral cleavage”characteristics.When combined with the“collateral cleavage”ability of Cas protein and isothermal amplification,CRISPR/Cas systems have great potential to advance nucleic acid detection.This article summarizes the research progress of different CRISPR/Cas systems and their applications in nucleic acid detection and future perspectives. 展开更多
关键词 crispr/Cas PATHOGEN Clinical application
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基于CRISPR-Cas12a系统的病原体核酸床旁检测技术方法研究的最新进展
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作者 王思琦 吴泽 余楠 《现代检验医学杂志》 2025年第1期213-220,共8页
病原体核酸检测是精准诊断、治疗和预防感染性疾病的重要环节,即时、简便的床旁检测(POCT)的研制对于实现病原体核酸高效检测意义重大。一种基因编辑工具被发现应用于核酸检测方法高效而实用,此即成簇的规则间隔的短回文重复序列及其相... 病原体核酸检测是精准诊断、治疗和预防感染性疾病的重要环节,即时、简便的床旁检测(POCT)的研制对于实现病原体核酸高效检测意义重大。一种基因编辑工具被发现应用于核酸检测方法高效而实用,此即成簇的规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR-Cas)系统,其中,结构简单的CRISPR-Cas12a因其强大的靶向结合、反式切割基因片段功能而得以广泛应用。基于CRISPR-Cas12a系统的病原体核酸检测方法,利用等温或变温核酸扩增技术以及光学信号作为检测介质的POCT技术,具有高灵敏度、高特异度和检测流程简化等特点。该文主要介绍基于CRISPR-Cas12a系统的病原核酸检测POCT技术方法的最新研究进展,为研制快速、准确的病原体核酸检测方法提供新思路。 展开更多
关键词 成簇的规则间隔的短回文重复序列相关蛋白系统 病原体核酸检测 床旁检测
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CRISPR-Cas技术在食品微生物检验中的应用
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作者 冯雪 《食品安全导刊》 2025年第3期187-189,共3页
食品安全检测是保障公众健康的重要环节。CRISPR-Cas技术作为一种新型的基因编辑工具,在食品微生物检验领域展现出广阔的应用前景。本文系统综述了CRISPR-Cas技术的基本原理及其在乳制品、肉类、水产品和果蔬等不同食品微生物检验中的应... 食品安全检测是保障公众健康的重要环节。CRISPR-Cas技术作为一种新型的基因编辑工具,在食品微生物检验领域展现出广阔的应用前景。本文系统综述了CRISPR-Cas技术的基本原理及其在乳制品、肉类、水产品和果蔬等不同食品微生物检验中的应用,为进一步推动CRISPR-Cas技术在食品安全领域的应用提供参考。 展开更多
关键词 crispr-Cas技术 食品安全 微生物检验
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CRISPR/CAS9敲除PD-1的肿瘤浸润T淋巴细胞回输对小鼠结肠癌的治疗作用 被引量:1
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作者 瞿紫微 李晓辉 +3 位作者 郭建辉 陈华涛 吴彪 孟庆彬 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期1189-1196,共8页
目的:探讨应用成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas9)技术敲除程序性死亡分子-1(PD-1)的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)回输对结肠癌小鼠的治疗作用。方法:皮下注射CT26构建小鼠结肠癌模型,从3只模型小鼠肿瘤组织中提取TIL,并... 目的:探讨应用成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas9)技术敲除程序性死亡分子-1(PD-1)的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)回输对结肠癌小鼠的治疗作用。方法:皮下注射CT26构建小鼠结肠癌模型,从3只模型小鼠肿瘤组织中提取TIL,并提取外周血淋巴细胞;对TIL进行PD-1基因敲除;回输实验分为对照组(Control)、输注淋巴细胞组(Lym)、输注荷瘤小鼠TIL组(TIL)、慢病毒空载对照组(pVSV-G-PX458-NC)组、PX458-PD-1-sgRNA1组(PD-1-sgRNA1),每组10只;测量各组小鼠肿瘤组织质量及肿瘤抑制率;TUNEL法检测各组小鼠肿瘤组织细胞凋亡;ELISA检测各组小鼠肿瘤组织TNF-α和IFN-γ含量;免疫组化检测肿瘤组织CD4+T、CD8+T细胞表达;免疫荧光法检测肿瘤组织细胞增殖核抗原-67(Ki-67)和血管内皮生长因子(VEGF)表达;Western blot检测肿瘤组织PD-1及其主要配体PD-L1表达。结果:PD-1-sgRNA1能明显抑制小鼠肿瘤细胞体内生长,抑制肿瘤组织Ki-67和VEGF表达及PD-1、PD-L1表达,提高肿瘤组织细胞凋亡率、TNF-α、IFN-γ含量、CD4+T、CD8+T细胞表达(均P<0.05)。结论:CRISPR/CAS9敲除PD-1的TIL回输能明显抑制结肠癌小鼠肿瘤组织Ki-67和VEGF表达,增加CD4+T、CD8+T细胞,诱导肿瘤细胞凋亡,发挥抑制肿瘤生长作用。 展开更多
关键词 crispr/Cas9 PD-1 结肠癌 肿瘤浸润淋巴细胞 肿瘤生长
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三江源地区鼠疫耶尔森菌CRISPR基因分型及流行特征研究 被引量:1
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作者 柏吉祥 靳娟 +7 位作者 李胜 辛有全 杨晓艳 张琪 金泳 张丽 代瑞霞 何建 《中华卫生杀虫药械》 CAS 2024年第2期161-165,共5页
目的了解三江源地区鼠疫菌株分布情况,进行规律间隔成簇短回文重复序列(Clustered regularly in-terspaced short palindromic repeats)基因分型研究,为该地区鼠疫疫源地菌株鉴定溯源、科学防控提供理论依据。方法选取三江源地区310株... 目的了解三江源地区鼠疫菌株分布情况,进行规律间隔成簇短回文重复序列(Clustered regularly in-terspaced short palindromic repeats)基因分型研究,为该地区鼠疫疫源地菌株鉴定溯源、科学防控提供理论依据。方法选取三江源地区310株鼠疫菌提取DNA,分别PCR扩增、测序3个CRISPR的位点YPa、YPb和YPc,所测得CRISPR序列与CRISPR Dictionary数据库最新数据进行比对,鉴定CRISPR spacer阵列并对三江源地区鼠疫菌进行基因分型。对310株鼠疫菌结合CRISPR基因型和分离宿主信息进行统计分析。结果310株鼠疫菌共发现26种spacer,分别为YPa15种、YPb8种、YPc3种;310株鼠疫菌被分成16个不同CRISPR基因型,G22型和G22-a1′型分布于整个三江源地区包括称多县、治多县、玉树市、曲麻莱县、囊谦县、杂多县、玛多县、玛沁县、同仁县、泽库县、共和县、同德县、贵德县;G24型分布于泽库县、玛多县、囊谦县、称多县;G26-a1′型主要分布于共和县、兴海县、贵德县、玛多县、称多县、杂多县,16个基因型归类为7个CRISPR类群:Cb4、Cb4′、Ca7、Ca7′、Ca8、Ca35′、Cc3′。结论三江源地区鼠疫菌CRISPR基因型具有多样性,不同疫源地基因型分布特征显著,且不同菌株基因型存在差异。 展开更多
关键词 鼠疫菌 crispr 三江源地区 基因分型 鼠疫菌自然疫源地
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CRISPR/Cas9技术在热带作物育种中的应用研究进展
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作者 王静毅 甘珊珊 +1 位作者 贾彩红 刘菊华 《植物遗传资源学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期312-322,共11页
在热带地区种植的香蕉、番木瓜、甘蔗、木薯、天然橡胶、油棕等热带作物,是我国农业的重要组成部分,不仅为我们的日常生活和工农业生产提供了重要的原材料,而且为我国热带与亚热带地区的主要农业产量和经济增长做出了贡献。然而,这些作... 在热带地区种植的香蕉、番木瓜、甘蔗、木薯、天然橡胶、油棕等热带作物,是我国农业的重要组成部分,不仅为我们的日常生活和工农业生产提供了重要的原材料,而且为我国热带与亚热带地区的主要农业产量和经济增长做出了贡献。然而,这些作物的现代分子育种受其生物学特性和遗传复杂性的严重阻碍,多倍化、杂合性、无性繁殖、童期长和植株高大等问题导致热带作物的传统杂交育种周期长、难度大、进展慢。基因编辑技术的发展为热带作物育种带来了新途径和新机遇。CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术以其更高的靶向效率、多功能性和易用性,已被广泛应用于植物基因组编辑育种中。近年来,该技术在香蕉、木薯、天然橡胶、甘蔗等热带作物上也实现了广泛应用。本文介绍了基于CRISPR-Cas9系统的基因组编辑、CRISPR-Cas9在热带作物改良中的应用进展以及所面临的挑战和问题,同时对热带作物基因编辑育种方面提出建议,以期为后续研究提供思路,并为进一步开发应用该技术以有效改良热带作物的植物性状提供参考。 展开更多
关键词 热带作物 基因组编辑 crispr/Cas9
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基于RAA-CRISPR/Cas12a技术的桃成分单管一体化快速检测方法
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作者 王琳 邢冉冉 +5 位作者 于耀鲜 易秋菊 卢思远 邓婷婷 王旭 陈颖 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2024年第21期280-287,共8页
通过设计特异性的桃重组酶介导的等温扩增(recombinase-aided amplification,RAA)和CRISPR RNA(crRNA)引物,建立RAA技术结合CRISPR/Cas12a系统的单管一体化桃成分快速检测方法,并分析该方法的特异性、灵敏度和检出限,同时对市售样品进... 通过设计特异性的桃重组酶介导的等温扩增(recombinase-aided amplification,RAA)和CRISPR RNA(crRNA)引物,建立RAA技术结合CRISPR/Cas12a系统的单管一体化桃成分快速检测方法,并分析该方法的特异性、灵敏度和检出限,同时对市售样品进行检测。结果显示,该方法不依赖大型仪器设备,在30 min内即可完成桃成分的快速检测;与其他常见水果物种之间无交叉污染,表现出良好的特异性;该方法的灵敏度为1.0×10-1 ng/μL;检出限为1%;通过对20份市售样品检测,结果显示本方法与实时聚合酶链式反应法检测结果一致。因此,本研究建立的RAA-CRISPR/Cas12a单管一体化桃成分快速检测方法具有特异性好、灵敏度高的优点,为桃成分快速检测提供了一种新的技术。 展开更多
关键词 重组酶介导的等温扩增 crispr/Cas12a 单管一体化 桃成分 快速检测
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橡胶树CRISPR/Cas9编辑植株出现预期表型的突变阈值
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作者 杨先锋 林秋飞 +4 位作者 JINU Udayabhanu 李季 钱遵超 邓玉婷 黄天带 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2024年第8期1521-1527,共7页
本课题组前期在橡胶树原生质体中分别实现了基于CRISPR/Cas9-RNP及质粒介导的瞬时转化基因编辑,并以HbPDS基因为靶标,在橡胶树愈伤组织中实现了农杆菌介导的稳定转化基因编辑,并获得了出现白化表型的愈伤组织,但由于橡胶树愈伤诱导体胚... 本课题组前期在橡胶树原生质体中分别实现了基于CRISPR/Cas9-RNP及质粒介导的瞬时转化基因编辑,并以HbPDS基因为靶标,在橡胶树愈伤组织中实现了农杆菌介导的稳定转化基因编辑,并获得了出现白化表型的愈伤组织,但由于橡胶树愈伤诱导体胚的技术还不稳定,导致未能获得基因编辑植株。为了获得橡胶树基因编辑幼苗,本研究继续以HbPDS基因为靶标,改用橡胶树体胚为侵染受体,开展农杆菌介导的遗传转化,经潮霉素抗性筛选获得增殖的T_0代抗性体胚,通过Cas9基因分子检测共挑选出116个阳性转化体胚,通过对靶点处的测序检测发现有5个胚块发生了基因编辑,编辑效率为4.3%。通过植株再生程序,获得了2株再生植株,表型观测均是嵌合体,表现为同一编辑植株上同时存在绿色及白化叶片。同时取白化叶片和绿色叶片进行高通量测序,发现二者均已发生了基因编辑,除了1个白化叶片发生了纯合双等位突变之外,其余叶片均为嵌合突变。其中,白化叶片编辑细胞的占比介于86%~100%之间,而绿色部位编辑细胞所占比例介于66%~69%之间,说明橡胶树CRISPR/Cas9编辑植株出现预期表型的突变阈值高于69%,介于70%~85%之间,为今后创制有表型的橡胶树基因编辑幼苗提供理论指导。同时,本研究证明了T_0代转化体胚及其获得的再生植株嵌合比例太高,不宜作为植株再生的材料,为今后通过对T_0代阳性体胚进行继代获得T_1代纯合体胚,并以T_1代体胚为转化受体获得纯合基因编辑植株提供思路。本研究首次公开报道获得了橡胶树基因编辑植株,尽管是嵌合植株,但也增进了对CRISPR/Cas9在橡胶树中作用的理解,为下一步在橡胶树中改进并应用基因编辑技术奠定基础。 展开更多
关键词 橡胶树 crispr/Cas9 HbPDS基因 基因编辑 突变阈值
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利用CRISPR/Cas9技术编辑OsOFP30基因创制水稻粒型突变体
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作者 何勇 刘耀威 +7 位作者 熊翔 祝丹晨 王爱群 马拉娜 王廷宝 张健 李建雄 田志宏 《中国水稻科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期507-515,共9页
【目的】研究水稻OFP家族转录因子OsOFP30对粒型的影响,创制新的粒型突变材料,为水稻粒型改良提供参考。【方法】以粳稻品种中花11为受体材料,利用CRISPR/Cas9技术对OsOFP30基因进行定向编辑;通过T_(0)、T_(1)和T_(2)代连续筛选,获得3... 【目的】研究水稻OFP家族转录因子OsOFP30对粒型的影响,创制新的粒型突变材料,为水稻粒型改良提供参考。【方法】以粳稻品种中花11为受体材料,利用CRISPR/Cas9技术对OsOFP30基因进行定向编辑;通过T_(0)、T_(1)和T_(2)代连续筛选,获得3类无外源片段插入的纯合突变体(长片段删除突变OsOFP30^(-89)、单碱基插入突变OsOFP30^(+1G)和OsOFP30^(+1A));分析粒型变异,进行生物信息学和测序分析,初步确定粒型变异原因。【结果】与野生型相比,3类突变体的粒宽和千粒重都显著降低,OsOFP30^(-89)和OsOFP30^(+1G)仅粒长和粒厚显著降低,穗型指标与野生型无明显差异,OsOFP30^(+1A)的粒长和粒厚与野生型无明显差异,仅一次枝梗数显著低于野生型;生物信息学分析表明,这3类突变体均由移码突变导致的翻译提前终止所产生,OsOFP30^(-89)突变蛋白长度为252个氨基酸,OsOFP30^(+1G)和OsOFP30^(+1A)突变蛋白长度均为282个氨基酸,两者仅第323位的核酸序列存在G和A的单碱基差异,导致突变蛋白第108位产生丝氨酸和天冬酰胺的差别。【结论】初步判断OsOFP30基因可调控水稻粒型变异。本研究创制了新的粒型突变材料,可为水稻粒型改良育种提供参考。 展开更多
关键词 水稻 OsOFP30 crispr/Cas9 基因编辑 粒型
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利用CRISPR/Cas9构建敲除小鼠模型研究PPP2R3A基因对心脏功能的影响
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作者 李洁 崔晓花 +2 位作者 梁媛 李小凤 宋贵波 《中国老年学杂志》 CAS 北大核心 2024年第7期1657-1661,共5页
目的 应用CRISPR/Cas9技术构建蛋白磷酸2调节亚基B″家族α亚型(PPP2R3A)基因敲除小鼠,从分子水平及组织水平上研究PPP2R3A缺失对心脏的影响。方法 将Cas9 mRNA和两个靶向PPP2R3A第3外显子翻译起始密码子附近区域的单导向RNA微注射到C57... 目的 应用CRISPR/Cas9技术构建蛋白磷酸2调节亚基B″家族α亚型(PPP2R3A)基因敲除小鼠,从分子水平及组织水平上研究PPP2R3A缺失对心脏的影响。方法 将Cas9 mRNA和两个靶向PPP2R3A第3外显子翻译起始密码子附近区域的单导向RNA微注射到C57BL/6小鼠受精卵中。小鼠出生后取其基因组DNA进行聚合酶链反应(PCR)和测序以鉴定基因型,鉴定后,基因PPP2R3A缺失型小鼠为KO组,野生型C57BL/6小鼠为WT组(雄性3只,雌性2只)。小鼠心脏组织经甲醛固定并制成切片后分别进行苏木素-伊红(HE)染色和免疫组织化学染色。提取小鼠心脏组织总RNA和蛋白,应用荧光定量PCR和Western印迹验证基因敲除小鼠的有效性和检测互作蛋白表达。结果 获得F1代PPP2R3A杂合小鼠,PCR和测序结果表明突变小鼠的基因型存在113 bp的缺失突变。与WT组相比,KO组心脏组织中PPP2R3A mRNA和蛋白表达量明显下降(均P<0.05),参与心脏发育的G蛋白信号转导调控因子(RGS)19表达量明显升高(P<0.05)。PPP2R3A蛋白表达受损引起了心脏组织病理学变化。结论 PPP2R3A在体内可能通过与RGS19蛋白互作来参与心脏的发育并对心脏功能产生影响。 展开更多
关键词 crispr/Cas9 蛋白磷酸2调节亚基B″家族α亚型(PPP2R3A) G蛋白信号转导调控因子(RGS)19 基因敲除小鼠
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基于CRISPR/Cas系统的检测技术在老年感染性疾病常见病原体中的研究进展
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作者 竺婷婷 刘芳 江咏梅 《遵义医科大学学报》 2024年第9期926-934,共9页
老年感染性疾病是全球老年人死亡的主要原因之一。由于老年人免疫力下降,合并慢性基础疾病等因素,导致其感染因素更复杂且临床表现各异。及早、快速和准确地鉴别出老年感染性病原体,对临床精准的抗感染治疗,减少老年病人并发症及降低死... 老年感染性疾病是全球老年人死亡的主要原因之一。由于老年人免疫力下降,合并慢性基础疾病等因素,导致其感染因素更复杂且临床表现各异。及早、快速和准确地鉴别出老年感染性病原体,对临床精准的抗感染治疗,减少老年病人并发症及降低死亡率有重要意义。传统病原体检测方法存在依赖标本活菌,检测时间长,检测人员准入条件高或依赖昂贵仪器等缺点。随着CRISPR/Cas系统在微生物检测中的应用,基于CRISPR/Cas系统的检测技术在老年感染性疾病病原体应用的优势也日渐突出。CRISPR/Cas系统能高效准确地鉴定出病原体,尤其是对于标本量少、微生物丰度低、采样困难或需要快速床旁检测的老年感染性疾病的辅助诊断具有重要的价值。本文主要对基于CRISPR/Cas系统的检测技术在老年感染性疾病病原体检测方面的研究进展进行综述。 展开更多
关键词 crispr/Cas 老年感染性疾病 病原体检测
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基于CRISPR/Cas12a的叶酸代谢位点MTHFR基因C677T多态性检测方法的建立
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作者 田石 安莉莎 +3 位作者 马瑶 金孝华 马旭 张璐 《生殖医学杂志》 CAS 2024年第6期785-791,共7页
目的开发一种基于CRISPR/Cas12a技术的叶酸代谢位点c.677(MTHFR C677T)的高效检测方法,以实现对C677T多态性的快速、准确分析。方法采用重组酶聚合酶扩增(RPA)结合CRISPR/Cas12a建立单管检测反应体系,建立人MTHFR基因C677T基因分型策略... 目的开发一种基于CRISPR/Cas12a技术的叶酸代谢位点c.677(MTHFR C677T)的高效检测方法,以实现对C677T多态性的快速、准确分析。方法采用重组酶聚合酶扩增(RPA)结合CRISPR/Cas12a建立单管检测反应体系,建立人MTHFR基因C677T基因分型策略;测试200例孕妇人群样本MTHFR基因C677T多态性,并与常规PCR产物测序结果进行一致率比较。结果基于CRISPR/Cas12a检测人MTHFR基因C677T多态性的检测方法结果准确、特异性好,与PCR产物测序结果具有高度一致性。结论建立的基于CRISPR/Cas12a检测技术的人MTHFR C677T基因分型方法简单、快捷、精准,为叶酸代谢位点MTHFR C677T基因型检测提供了新的途径,具有潜在的临床应用前景。 展开更多
关键词 人亚甲基四氢叶酸还原酶基因 多态性 crispr/Cas12a 恒温扩增
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CRISPR/Cas系统在核酸检测中的应用和挑战
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作者 张钧 张路 孔莹莹 《浙江医学》 CAS 2024年第3期225-233,250,共10页
成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关基因(Cas)系统是古菌和细菌适应性免疫系统,最初被发现用来进行基因编辑,近年其特异识别和切割特性以及可编程性使其在核酸和非核酸靶标检测中崭露头角。目前基于CRISPR/Cas系统的核... 成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关基因(Cas)系统是古菌和细菌适应性免疫系统,最初被发现用来进行基因编辑,近年其特异识别和切割特性以及可编程性使其在核酸和非核酸靶标检测中崭露头角。目前基于CRISPR/Cas系统的核酸检测系统主要与核酸扩增技术如PCR、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)和EXPAR等恒温扩增技术结合,以提高灵敏度;多项研究也在尝试开发基于CRISPR/Cas的无预扩增核酸检测系统;另外也有研究尝试通过生物祖体(包括适体、DNAzymes和抗原-抗体反应)特异性识别靶物质实现非核酸信号转换为核酸信号,实现基于CRISPR/Cas的蛋白质、小分子、细胞等非核酸物质的检测。但仍存在一些挑战,其中目标中痕量原始浓度的信号转换和放大是分析系统的关键挑战;其他挑战包括CRISPR/Cas存在一定背景活性,CRISPR RNA和单链DNA/单链RNA信号报告序列有降解风险等。随着技术的逐渐成熟,CRISPR/Cas系统将在生物靶标检测中发挥更大作用。本文就CRISPR/Cas系统在核酸检测这一领域的最新发展方向作一述评。 展开更多
关键词 crispr/Cas系统 检测 诊断 核酸
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利用CRISPR/Cas9系统创制水稻品种GW2基因的突变体
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作者 颜静宛 陈子强 +1 位作者 周淑芬 王锋 《江苏农业科学》 北大核心 2024年第3期73-78,共6页
培育具有育种价值的GW2基因编辑的水稻优异新品种在水稻育种中具有重要意义,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以生产上广泛推广应用的13份水稻品种为材料,对粒质量基因(GW2)进行定向性状改良,通过农杆菌转化创制出一批无T-DNA元件的水稻非... 培育具有育种价值的GW2基因编辑的水稻优异新品种在水稻育种中具有重要意义,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以生产上广泛推广应用的13份水稻品种为材料,对粒质量基因(GW2)进行定向性状改良,通过农杆菌转化创制出一批无T-DNA元件的水稻非转基因GW2突变纯合株系。结果表明:13份T0代水稻转基因中,有28.0%~59.1%植株的GW2基因发生了突变,纯合突变株数量占总突变株数量的35.0%,双等位突变株数量占总突变株数量的14.2%,杂合突变株数量占总突变株数量的50.8%。此外,不同水稻品种发生的突变类型也略有不同。对13份T2代非转基因水稻GW2突变纯合株进行千粒质量性状的考种分析。与对应的野生型亲本品种相比,纯合突变水稻植株的千粒质量显著提高10.81%~58.22%。本研究结果极大地丰富了GW2的突变类型,为不同水稻品种的高产稳产创造了重要的种质资源,同时也为利用基因编辑提高水稻产量提供了有价值的育种信息。 展开更多
关键词 水稻 crispr/Cas9 基因编辑 粒质量 GW2基因 突变
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