Taq DNA聚合酶的分子改造及其在探针法qPCR直扩体系中的应用

Taq DNA聚合酶作为实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)技术的核心组分,其性能优劣直接影响qPCR技术的进一步发展。然而,野生型Taq DNA聚合酶的耐抑制剂性能差、延伸性能不足。为获得具有高性能的Taq DNA聚合酶,采用基因工程技术将双链DNA结合蛋白Sso7d或Sto7d融合在野生型Taq DNA聚合酶的N端或C端,构建了4个均可溶表达的改造体,再经过耐受性测试筛选较优的改造体,结果显示:改造体Taq-Sto的耐受性最高,其热稳定性不受影响,且在1 s/kbp的延伸条件下能成功扩增靶标,表明Taq-Sto具有增强的延伸性能,在TaqMan探针法qPCR体系中对腐殖酸、单宁酸、全血等抑制剂同样表现出良好的耐受性。EMSA实验发现:Taq-Sto对DNA模板的结合亲和力有所提高,有利于增强Taq-Sto对模板的竞争力;将Taq-Sto应用于非洲猪瘟病毒(ASFV)的TaqMan探针法qPCR检测,与商品化试剂相比,Taq-Sto具有更低的ASFV检出限,且在体积分数为2%~6%的猪粪便样本或猪肉样本中的检测灵敏度分别为100.0%和85.4%,说明Taq-Sto在直扩qPCR检测领域更具有优势。

DVC1在氮芥致人支气管上皮细胞DNA-蛋白交联损伤修复中的作用

目的探讨蛋白水解酶DVC1在氮芥诱导人支气管上皮细胞DNA-蛋白交联损伤修复中的作用。方法利用siRNA干预DVC1表达,50μmol/L氮芥染毒细胞后,采用Western blot检测DNA损伤修复蛋白的表达;荧光酶标仪测定1~24 h DNA-蛋白交联总量;Slot blot检测DNA与O 6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O^(6)-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)的共价交联;免疫沉淀检测MGMT泛素化水平。构建GST-DVC1融合蛋白,GST下拉实验检测DVC1与MGMT、泛素的结合。结果si-DVC1干预后,DNA-蛋白交联总量升高。氮芥降低交联蛋白MGMT原型的水平,但增强其泛素化水平;DVC1可结合泛素,si-DVC1可进一步增强MGMT的泛素化及DNA-MGMT的交联量,与泛素结合酶抑制剂NSC697923和蛋白酶体抑制剂MG132引起的交联结果类似。si-DVC1引起DNA损伤修复蛋白Rad51表达降低、Ku70表达升高。结论DNA-蛋白交联的清除依赖于交联蛋白的泛素化;DVC1通过与泛素相互作用,促进氮芥诱导的DNA-蛋白交联的清除,并维持DNA以同源重组方式修复损伤的能力。

脱氧核糖核酸拓扑异构酶Ⅱβ结合蛋白1与肿瘤的研究进展

脱氧核糖核酸(DNA)损伤应答(DDR)是维持内稳态及肿瘤发展重要机制之一。DNA拓扑异构酶Ⅱβ结合蛋白1(TopBP1)在维持基因组稳定性及调控DDR相关信号通路中扮演着关键角色。最新研究发现,TopBP1通过多种分子机制促进肿瘤细胞的生长、转移及耐药,并且与肿瘤发病风险及预后显著相关。本文对TopBP1在乳腺及妇科、呼吸及消化系统肿瘤中的最新研究进展进行综述,以期深入了解TopBP1在不同肿瘤中的作用机制,推动其转化为临床标志物或药物干预靶点,并为基于DDR的抗癌策略提供新思路。

一种嵌合式DNA聚合酶的表达及功能验证

为了建立一套基于大肠杆菌表达系统的嵌合式高保真DNA聚合酶的重组表达与纯化的工艺,首先将含有目的基因的质粒转化至大肠杆菌BL21中,通过高压破碎仪进行细胞破碎,再用离子交换层析方法获得嵌合型高保真聚合酶。优化反应条件显示在28℃自动诱导下表达的嵌合DNA聚合酶蛋白产量较高。利用高压破碎仪将细胞破碎获得可溶蛋白,然后利用硫酸铵沉淀将蛋白粗纯,并采用离子交换层析柱纯化,最终获得较纯的DNA聚合酶。通过对获得的嵌合DNA聚合酶进行活性分析,证实该聚合酶具有高效的活性,为以后大规模生产高保真DNA聚合酶奠定基础。

甲醛致核酸损伤作用的实验研究

应用单细胞凝胶电泳技术(SCGE)和液相色谱-电化学检测法(HPLC-EC)研究了典型环境污染物甲醛对DNA分子的损伤效应.结果表明:甲醛不仅可诱导人外周血淋巴细胞DNA发生链断裂,还可引起DNA DNA,DNA 蛋白质交联;甲醛与小牛胸腺DNA的体外作用较弱,但在铁离子介导下对DNA的氧化能力增强,可产生一定量的8 羟基脱氧鸟苷(8 OHdG)加合物;动物实验表明甲醛诱导大鼠肺组织DNA氧化损伤生成8 OHdG,提示甲醛较强的遗传毒性.

不同浓度甲醛致小鼠肾细胞DNA损伤效应研究

为了探讨甲醛导致生物机体内的DNA损伤效应及其剂量-效应关系,通过不同浓度的液态甲醛对小鼠肾细胞进行染毒,并分别运用了单细胞凝胶电泳实验、荧光检测法实验和KCl-SDS沉淀法实验进行研究.结果显示,甲醛在低浓度(5μmo·lL-1)时,具有致DNA断裂的作用;在中等浓度(25μmo·lL-1)时,对DNA的损伤作用以DNA-DNA交联为主;在高浓度(125、625μmo·lL-1)时,对DNA的损伤作用以DNA-蛋白质交联为主.

乙醛对脱氧核糖核酸分子的损伤作用

应用单细胞凝胶电泳技术和液相色谱 电化学检测法研究了典型环境污染物乙醛对脱氧核糖核酸 (DNA)分子的损伤效应 .结果表明 :乙醛不仅可诱导人外周血淋巴细胞DNA发生链断裂 ,还可引起DNA DNA ,DNA 蛋白质交联 ;乙醛与小牛胸腺DNA的体外作用较弱 ,但在铁离子介导下对DNA的氧化能力增强 ,可产生一定量的 8 羟基脱氧鸟苷 (8 OHdG)加合物 ;动物实验表明 ,乙醛诱导大鼠肺组织DNA氧化损伤生成 8 OHdG ,提示乙醛具有潜在遗传毒性 ,可能与引起DNA交联及氧化有关 .

甲醛致小鼠肺DNA蛋白质交联和DNA断裂效应的研究

目的研究甲醛致小鼠肺DNA-蛋白质的交联(DNA-prote in crosslinks,DPC)和致DNA的断裂作用。方法以小鼠肺为材料,经体外染毒后,采用KC l-SDS沉淀法和单细胞凝胶电泳法检测液态甲醛染毒后肺部提取细胞中DNA-蛋白质交联物的含量及DNA的断裂效应。结果KC l-SDS沉淀法,低浓度的液态甲醛(5μM,25μM)不能引起DNA-蛋白质的交联(P>0.05),较高浓度(125μM,625μM)可以引起明显的DNA-蛋白质的交联作用(125μM,P<0.05;625μM,P<0.01)。而单细胞凝胶电泳法显示甲醛在低浓度(5μM,25μM)时可以引起DNA链的断裂(P<0.01),在较高浓度(125μM,625μM)时可以引起交联作用(P<0.01)。结论甲醛在较高浓度时可以导致明显的DNA-蛋白质交联作用,而在<25μM时以DNA断裂为主。

气态甲醛对卡氏毛园蛛细胞遗传毒性的研究

为了研究气态甲醛对蜘蛛的遗传毒性,采用单细胞凝胶电泳实验及KCl-SDS沉淀法检测了卡氏毛园蛛(Eriovixia cavaleriei)暴露于气态甲醛(0、0.5、1.0、3.0mg·m-3)后的细胞DNA分子断裂、DNA-DNA交联、DNA-蛋白质交联状况,并以甲醛的水溶性实验为基础,总结了甲醛对不同动物细胞的遗传毒性.结果显示,中、低浓度甲醛(0.5、1.0mg·m-3)可引起卡氏毛园蛛细胞DNA链断裂,高浓度甲醛(3.0mg·m-3)除引起DNA链断裂外,还可诱导核内交联物的形成;随着甲醛染毒浓度的升高,DNA的损伤程度逐渐加重,显示出一定的剂量-效应关系.通过总结甲醛对不同动物的遗传毒性发现,随着甲醛浓度的升高(5～625μmol·L-1,生理盐水溶液),动物细胞DNA损伤基本表现为由DNA链断裂(DSB)→DNA-DNA交联(DDC)→DNA-蛋白质交联(DPC)的过渡;甲醛所致的DNA损伤在不同动物细胞中也存在差异,反映了不同动物细胞对甲醛的敏感性不同。

气态甲醛致雌性小鼠生殖细胞DNA-蛋白质交联的研究

为了研究气态甲醛对雌性小鼠生殖细胞的影响,以昆明雌性小鼠卵巢为实验材料,采取动态吸入式染毒方式,应用KCl-SDS沉淀法检测了气态甲醛染毒后所引起的小鼠卵巢生殖细胞DNA-蛋白质交联(DPC)效应.结果表明,较低浓度的甲醛(0.5mg·m-3),即可导致明显的DPC效应(与对照相比,p<0.05),并且随着染毒浓度的升高(0.5、1.0、3.0mg·m-3),DPC系数也逐渐升高.上述结果表明在实验所设浓度范围内,甲醛对小鼠卵巢生殖细胞的DNA损伤可以引起DNA-蛋白质的交联,并且DPC系数随着染毒浓度的增大而增大.DNA-蛋白质交联是DNA分子的一种严重损伤,气态甲醛对雌性小鼠生殖细胞具有一定的影响.

DNA依赖蛋白激酶在Ⅰ～Ⅱ期非小细胞肺癌中的表达及意义

背景与目的Ku70基因、Ku80基因和DNA-PKcs基因是DNA双链断裂修复的主要因子。本研究的目的是探讨Ku70、Ku80和DNA-PKcs蛋白在Ⅰ～Ⅱ期非小细胞肺癌中的表达及其临床意义。方法利用组织芯片(tissue microarray,TMA)技术和免疫组织化学二步法,对86例行术后辅助化疗的早期非小细胞肺癌标本进行上述3种重组修复相关蛋白的检测。结果在肺癌组织中Ku70、Ku80、DNA-PKcs蛋白的阳性率分别为68.6%、72.1%和87.2%,其表达与临床病理类型无明显关系(P>0.05)。预后较差的患者Ku70、Ku80、DNA-PKcs的表达水平有高于预后较好患者的趋势,但其差异无统计学意义(P>0.05)。结论Ku70、Ku80、DNA-PKcs在未经化疗的肺癌组织中均有不同程度表达,其表达高低对早期非小细胞肺癌术后辅助化疗无指导意义。

序列特异性DNA断裂蛋白质

序列特异性ＤＮＡ断裂蛋白质是在序列特异性ＤＮＡ结合蛋白质及小分子ＤＮＡ断裂试剂基础上设计合成的。其基本原理是在含有ＤＮＡ结合域的蛋白质上引入一个金属螯合剂并螯合一个适当的金属离子，其中序列特异性ＤＮＡ结合蛋白质具有与ＤＮＡ特定序列结合的能力，从而可以起导向物的作用；而引入的金属螯合剂与金属离子复合物具有断裂ＤＮＡ的功能，两者协同作用可以达到序列特异性断裂ＤＮＡ的目的。

邻苯二甲酸二异辛酯致小鼠肝DNA蛋白质交联效应研究

邻苯二甲酸酯是一类广泛应用于人类生产和生活的酸酞酯类人造化学物,许多研究表明其具有广泛的生物学毒性。DNA-蛋白质交联(DNA-proteincrosslinks,DPC)是DNA分子的一种严重损伤。本文以小鼠肝为实验材料,采用Kcl-SDS沉淀法检测邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)腹腔注射染毒两周后,检测其导致的小鼠肝DPC效应。实验结果表明,低浓度的DEHP(62.5mg/kg)不能致DPC效应(P>0.05),随着染毒浓度的倍增(125mg/kg,250mg/kg,375mg/kg),其DPC系数也随之升高,可导致明显的DPC效应(P<0.01),而在500mg/kg染毒组,由于其染毒剂量达到小鼠的致死水平,其DPC效应虽然与空白对照组相比有极显著性差异(P<0.01),但<125mg/kg染毒组。结论DEHP在低浓度(62.5mg/kg)时不引起小鼠肝的DPC效应,但其DPC系数随着染毒浓度(125mg/kg,250mg/kg,375mg/kg)的升高而升高,可以导致明显的DPC效应,在染毒剂量(500mg/kg)达到致死水平的染毒组DPC系数明显降低,但仍明显高于空白对照组。

气态甲醛对小鼠外周血白细胞的DNA损伤作用

为研究气态甲醛对外周血白细胞DNA的损伤作用,选用SPF级昆明种纯系雄性小鼠作为研究对象,用浓度为0.5 mg/m2、1.0 mg/m2、3.0 mg/m3气态甲醛对小鼠进行连续动态染毒72 h,染毒结束后,观察外周血白细胞的DNA断裂和DNA-蛋白质交联的状况.实验表明:气态甲醛能诱导小鼠外周血白细胞的DNA断裂,在各染毒浓度组与对照组均有及显著差异,在0.5 mg/m3浓度组DNA断裂效应比1.0 mg/m2,3.0 mg/m3浓度组高;1.0 mg/m2,3.0 mg/m3浓度组出现明显的DNA-蛋白质交联作用.研究结果表明:气态甲醛暴露对小鼠外周血白细胞的DNA有明显的损伤作用.

耻垢分枝杆菌宿主整合因子(IHF)对DNA拓扑结构的影响

结核分枝杆菌(Mycobaterium tuberculosis)是结核病的病原菌,每年导致数百万人死亡.对于分枝杆菌基本生物学特性的研究有助于新的药物及治疗手段的研发.耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)是分枝杆菌属中的一种非致病菌,与结核分枝杆菌亲缘关系较近,是实验室常用的研究分枝杆菌的模式菌种.分枝杆菌主要编码三种染色质蛋白,类组蛋白HU、Lsr2和宿主整合因子IHF.为研究IHF在染色体包装中的作用,我们在大肠杆菌中表达、纯化了耻垢分枝杆菌IHF蛋白(MsIHF),并对其影响DNA拓扑结构的性质进行了系统分析.体外研究的结果表明,MsIHF以同二聚体的形式存在,其对负超螺旋DNA具有一定的结合偏好性,同时,该蛋白可以有效地固定DNA负超螺旋.进一步的研究表明,MsIHF可以调控拓扑异构酶的活性.MsIHF的结合明显地抑制拓扑异构酶Ⅰ的松弛活性,而与此相反,该蛋白可以轻微地促进旋转酶引入DNA负超螺旋的能力.以上结果提示,MsIHF可能通过调控拓扑异构酶的活性影响染色体DNA的结构,进而调控其包装.

甲醛致雄性大鼠脑和睾丸细胞DNA-蛋白质交联的研究

目的探讨气态甲醛致雄性大鼠脑细胞和睾丸细胞 DNA-蛋白质交联(DNA-protein crosslinks,DPC)作用。方法将24只 SPF 级 Wistar 雄性大鼠随机分为4组,每组6只,分别为0.5、1.0、3.0 mg/m^3气态甲醛染毒组和阴性对照组。连续动态吸入染毒72 h 后,应用 KCl-SDS 沉淀法检测大鼠脑和睾丸组织 DNA-蛋白质交联的含量。结果与阴性对照组比较,0.5mg/m^3气态甲醛染毒组大鼠脑和睾丸组织的 DPC 系数差异无统计学意义(P>0.05),随着甲醛浓度的增加,DPC 系数逐渐升高。与阴性对照组比较,1.0、3.0mg/m^3气态甲醛染毒组大鼠脑和睾丸组织 DPC 系数升高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论低浓度(0.5 mg/m^3)的气态甲醛不能引起大鼠脑和睾丸组织产生 DPC 效应,而较高浓度(1.0、3.0mg/m^3)的气态甲醛可明显诱导其产生 DPC 效应,造成严重的 DNA 损伤。

DNA依赖蛋白激酶研究进展

ＤＮＡ依赖蛋白激酶由Ｋｕ 异二聚体和ＤＮＡＰＫｃｓ 组成， 结合Ｋｕ 蛋白后， ＤＮＡＰＫ激酶活性激活， ＤＮＡ依赖蛋白激酶具有多功能性， 参与ＤＮＡ修复、基因重组以及复制、转录等多种细胞学过程．

顺铂对bcr/abl转化BaF3-P210细胞DNA损伤与修复能力的影响

目的:研究顺铂(cisplatin,Cis)对白血病BaF3-MIGR1细胞和bcr/abl转化BaF3-P210细胞中DNA损伤修复能力的影响。方法:锥虫蓝染色法检测2种细胞经0.5、1、5、10、20和40μg/mL Cis处理0、2、4、6、8、12、24和48 h时的存活率,免疫荧光法检测上述6种浓度Cis处理细胞8 h后诱导的γH2AX焦点数,Western印迹法检测DNA修复0、4、12和24 h后的γH2AX蛋白表达情况。结果:随着Cis处理时间和剂量增加,2种细胞的存活率降低,BaF3-P210转化细胞的存活率比BaF3-MIGR1细胞高(P<0.05);随着Cis剂量上升,2种细胞的γH2AX焦点数上升,BaF3-P210转化细胞的焦点数比BaF3-MIGR1细胞少(P<0.05);随着DNA修复时间延长,2种细胞的γH2AX蛋白表达均下调,BaF3-P210转化细胞的γH2AX蛋白表达量比BaF3-MIGR1细胞低。结论:Cis对BaF3-MIGR1细胞和BaF3-P210转化细胞的损伤呈时间、剂量效应,2种细胞的γH2AX焦点数与损伤之间存在剂量效应,bcr/abl可增强BaF3-P210转化细胞的DNA修复能力。

单细胞凝胶电泳技术的现场应用及健康人群的表现特征

目的介绍一种改良的单细胞凝胶电泳技术同时检测血白细胞ＤＮＡ链断裂和ＤＮＡ－蛋白交联并将其应用于部分健康人群。方法６０名健康人群，每人血样分Ａ、Ｂ两份，Ｂ份在细胞裂解后加蛋白酶Ｋ，其余同常规方法；Ｂ份尾矩为总的ＤＮＡ链断裂量，Ｂ份与Ａ份尾矩的差值为ＤＮＡ－蛋白交联量。结果ＤＮＡ链断裂在性别、年龄和饮酒与否方面的分布无显著性差异，而吸烟可使其显著增加；上述各因素对ＤＮＡ－蛋白交联均无显著影响，后者在该研究人群中的分布里正态（２．４６ ×１０６± ０．７０ ×１０６）。结论该研究为职业接触人群 ＤＮＡ损伤的监测提供了方法学和对照数据的参考。

变形链球菌表面蛋白PAc的原核表达及纯化

目的:对在大肠杆菌中表达重组变形链球菌表面蛋白抗原PAc的培养条件进行优化,制备高纯度重组蛋白rPAc。方法:载体构建原核表达载体pET20b(+)-AP对不同培养基、诱导浓度,温度和时间等进行筛选确定最佳条件,采用亲和层析分离纯化rPAc蛋白。结果:含原核表达载体pET20b(+)-AP的大肠杆菌在LB培养基中培养至A600=0.6时,终浓度为1mM的IPTG诱导,30℃继续振荡培养4h,可使rPAc的表达量达到最大。分离纯化的蛋白在SDS-PAGE中显示为单一条带。结论:对PAcA-P区的重组质粒pET20b(+)-AP表达的rPAc经纯化后可用于动物免疫,为探索防龋DNA疫苗pCIA-P的新型免疫策略奠定必要的物质基础。