基于稳定性同位素核酸探针技术的同化利用玉米秸秆碳微生物群落演替研究

[目的]研究秸秆分解过程中同化利用秸秆碳源的微生物生态演替过程,明确参与秸秆分解的主要微生物类群,为秸秆高效利用提供科学依据。[方法]采用^(13)C标记高丰度玉米秸秆。微宇宙室内培养试验的供试土壤为华北平原石灰性潮土。共设置3个处理:不添加秸秆(soil)、添加自然丰度秸秆(soil+^(12)C-straw)和添加13C标记秸秆(soil+^(13)C-straw)。培养30天时,结合同位素示踪与高通量测序等技术,测定秸秆添加对土壤有机碳的激发效应,分析利用秸秆碳源的细菌、真菌群落结构及其与土壤胞外酶活性的关系。[结果](1)秸秆添加显著提高了土壤CO^(2)排放,添加秸秆对土壤有机碳的激发效应在培养第1天达到峰值,土壤和秸秆CO^(2)排放比例均在培养第3天达到峰值。(2)整个培养时期共发现参与秸秆碳同化利用的细菌微生物操作分类单元(operational taxonomic units,OTU_(s))238个,真菌OTU_(s)24个。细菌OTU_(s)主要属于细菌变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)与绿弯菌门(Chloroflexi),真菌OTU_(s)主要为子囊菌门中的粪壳菌纲(Sordariomycetes)。(3)秸秆分解不同时期的微生物群落结构存在显著差异,在整个培养时期,以热单胞菌属(Thermomonas)与溶杆菌属(Lysobacter)为代表的7个细菌属快速响应秸秆添加,以假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)与土生单胞菌属(Terrimonas)为代表的6个细菌属延迟响应;两个真菌属枝鼻菌属(Cladorrhinum)与葡萄穗霉属(Stachybotrys)表现为对秸秆添加的快速响应,新赤壳属(Neocosmospora)与unclassified_f_Halosphaeriaceae为延迟响应。(4)曼特尔分析表明,细菌热单胞菌属(Thermomonas)、溶杆菌属(Lysobacter)、绿弯菌门(Chloroflexi)以及真菌裂壳菌属(Schizothecium)与碳氮转化相关土壤胞外酶活性呈显著正相关关系。[结论]外源秸秆添加对土壤有机碳产生正激发效应,显著增加了土壤CO^(2)排放。同化秸秆碳源的微生物随培养时间延长发生群落演替,细菌的热单胞菌属(Thermomonas)、溶杆菌属(Lysobacter)、绿弯菌门(Chloroflexi)以及真菌的裂壳菌属(Schizothecium)在玉米秸秆分解过程中具有重要作用,可为秸秆高效腐熟菌剂的研发提供依据。

水稻土好氧甲烷氧化菌对大气CO_(2)浓度升高的适应规律

CH4是仅次于CO_(2)的第二大温室气体,而稻田是CH4的主要排放源,未来大气CO_(2)浓度升高情景下(elevatedCO_(2),eCO_(2)),水稻土好氧甲烷氧化过程及其功能微生物群落适应规律尚不清楚。依托中国FACE(FreeAir CO_(2) Enrichment)水稻田试验平台,通过13C-CH4示踪的室内微宇宙培养实验,采用稳定性同位素核酸探针(DNA-SIP)和高通量测序技术,研究未来大气CO_(2)浓度升高对水稻土甲烷氧化活性及其功能微生物的影响规律。结果表明:与常规大气CO_(2)浓度(ambient CO_(2),aCO_(2))相比,eCO_(2)条件下的甲烷氧化活性显著增加,从243 nmol·g^(-1) d.w.s·h^(-1)增加至302 nmol·g^(-1) d.w.s·h^(-1),增幅高达24.3%,甲烷氧化菌数量则增加了1.1倍~1.2倍。通过超高速离心获得活性甲烷氧化菌同化13CH4后合成的13C-DNA,高通量测序发现,未来大气CO_(2)升高情景下水稻土活性好氧甲烷氧化微生物群落极可能发生明显演替,与对照相比,类型I甲烷氧化菌甲基杆菌属Methylobacter的相对丰度增加16.2%~17.0%,而甲基八叠球菌属Methylosarcina的相对丰度下降4.7%~11.1%;同时刺激了食酸菌属Acidovorax和假单胞菌属Pseudomonas等非甲烷氧化菌的活性。综上所述:未来大气CO_(2)升高情景下,水稻土好氧甲烷氧化微生物群落结构发生分异,促进了甲烷氧化通量,而甲烷氧化的代谢产物可能引发土壤中微生物食物网的级联反应,是土壤碳储存和周转的重要功能微生物群。

一种新型Al^(3+)荧光探针的合成及与DNA的相互作用

以2-羟基-1-萘甲醛、邻氨基苯甲醛为原料,设计合成了一种新型Schiff碱Al^(3+)荧光探针S,并通过1HNMR、^(13)CNMR、ESI-MS、IR对探针S进行结构表征。光谱实验结果表明,探针S在DMSO∶H_(2)O=4∶1(V/V)体系中,对Al^(3+)有良好的荧光和裸眼识别。Al^(3+)浓度在2.0~50μmol/L范围内,体系荧光强度呈现出良好的线性关系,检出限为0.033μmol/L,探针S与Al^(3+)形成1∶1的配合物。通过荧光光谱研究了荧光探针S-Al^(3+)配合物与DNA的相互作用,实验结果表明,探针S-Al^(3+)配合物对DNA的猝灭过程为动态猝灭,同时对不同温度下相互作用的结合点常数、结合位点数及热力学参数进行了计算,推断二者作用力的类型为疏水作用,作用方式为嵌插作用。

异核双金属探针在活细胞细胞核和线粒体中选择性定位DNA

用于实时成像活细胞DNA的细胞核探针是非常罕见的。通过Ru(N^N)3、Ir(C^N)2(N^N)、Re(CO)3Cl(N^N)和Pt(C^N)(N^N)的结合,生成了4种异核双金属配合物:2种不同的功能金属位点被锚定在线性双齿螯和配体(N^N)-(N^N)的尾端,形成不对称哑铃状的双金属分子M1-M2,即Ru-Re、Ru-Pt、Ir-Re和Ir-Pt。Ru-Re和Ru-Pt的红色发射探针具有较大的斯托克斯位移、优异的核膜穿透能力、良好光稳定性的DNA结合能力。此外,Ru-Re和Ru-Pt探针的DNA成像可与专门用于活细胞细胞核DNA染色的Hoechst 33342商用染料相媲美,而Ir-Re和Ir-Pt探针直接靶向线粒体。不同探针的发光特性和选择性胞内定位高度依赖于在异核双金属配合物中的金属物种。

基因靶点筛查快速确诊遗传性对称性红斑角化症的研究

目的建立一套快速准确确诊遗传性对称性红斑角化症的方法,为备孕家庭提供指导性意见。方法对35例患有遗传性对称性红斑角化症的新生儿的皮肤组织进行基因序列分析,筛查出导致遗传性对称性红斑角化症的突变点位,针对这些靶点基因设计对应的引物和基因探针,确立PCR的扩增条件,建立一整套快速准确筛查遗传性对称性红斑角化症的方法。结果35例遗传性对称性红斑角化症DNA对比分析发现KRT-XY区域存在点位异常。建立PCR基因靶点筛查系统,PCR基因靶点筛查遗传性对称性红斑角化症实验的阳性对照及样板参照结果均与预期一致。结论以DNA靶点为基础设计的引物、基因探针作为遗传性对称性红斑角化症基因靶点筛查具有极高的准确率,是快速筛查遗传性对称性红斑角化症的理想检测方法之一。

白斑综合症病毒(WSSV)的宿主调查

用地高辛 (DIG)标记的WSSVDNA探针斑点杂交与原位杂交技术 ,在中国对虾、斑节对虾、南美白对虾、刀额新对虾、脊尾白虾、天津厚蟹、日本大眼蟹体内检测到了WSSV ,它们是WSSV的天然宿主 ;在经人工感染的哈氏美人虾、短脊鼓虾、克氏原螯虾、肉球近方蟹、滕壶体内检测到了WSSV ;在球形侧腕水母、病虾池的桡足类等浮游生物、卤虫无节幼体以及人工浸泡感染卤虫成体体内没有检测到WSSV。经原位杂交检测 ,虾类的甲壳下上皮、胃上皮、附肢、造血组织、鳃等组织器官均可被WSSV侵染 ,其中甲壳下上皮和鳃对WSSV敏感 ;蟹类的甲壳下上皮和鳃对WSSV敏感 ;在中国对虾、南美白对虾、脊尾白虾、注射感染的克氏原螯虾的精巢中 ,精荚的结缔组织细胞和血细胞呈阳性 ,在中国对虾、脊尾白虾以及注射感染的短脊鼓虾的卵巢中 ,结缔组织细胞和滤泡细胞被WSSV感染。

用DNA探针检测我国栽培的无核葡萄及辅助育种初探

用葡萄无核基因的特异探针 18bp (5’CCAGTTCGCCCGTAAATG3’)检测了我国栽培的 2 1个无核葡萄品种和 9个有核对照品种的无核性 ,证实了该探针可以对葡萄无核基因进行准确的检测和鉴定 ;通过该探针对有核×无核 (红地球×红光无核 )杂交后代无核性状的鉴定 ,并对照大田结果 ,证明了 18bp检测葡萄无核基因探针具有预测葡萄无核性状的作用。

PCR法制备地高辛标记探针斑点杂交检测白斑综合症病毒(WSSV)

用 PCR法成功制备了 DIG标记探针 ,探针长度为 547bp,探针的产量为 2 1.6 ng/ μL。此探针与随机引物合成探针检测样品灵敏度相近。用此探针核酸斑点杂交法检测了 54尾中国对虾。结果表明 :此探针在对白斑综合症病毒的检测。

斑节对虾白斑综合症病毒部分基因组文库及核酸探针检测法

通过分离纯化白斑综合症病毒 (WSSV)粒子 ,抽提病毒DNA ,用限制性内切酶EcoRⅠ或SalⅠ酶切后 ,克隆入质粒pBluescriptⅡKS中 ,从而建立了WSSV部分基因组文库。估计WSSV基因组DNA在16 5kb以上。将WSSVEcoRⅠ克隆片段标记制备为探针 ,进行Southern杂交、打点杂交和原位杂交 ,其结果证明了克隆片段对WSSV特异 ,并为检测WSSV提供了方法。通过对部分基因组文库序列分析发现 ,WSSV核酸序列与已知杆状病毒核酸序列的同源性低 ,与GenBank中已有病毒核酸序列比较都无较大同源性 ,说明WSSV不属于杆状病毒科 ,目前只能列为未分类的无脊椎动物病毒 ,其分类地位尚需更多证据方能确定。

核酸斑点杂交分析法检测对虾皮下及造血组织坏死杆状病毒(HHNBV)

于1995年7月在青岛市城阳对虾养殖场采集患暴发性流行病的中国对虾样品，提纯HHNBV并研制了一组地高辛标记的HHNBV核酸探针。采用核酸斑点杂交方法研究了此组核酸探针的灵敏度和特异性。结果表明，此组探针检测HHNBVDNA的灵敏度为62.5pg，对469ng病虾胃中的病毒可以检出；此组探针与3．75ug健康对虾组织和2ng健康对虾DNA均无交叉反应。1997年，应用此组特异性核酸探针检测了发病虾池对虾及紧急抢捕虾，检测结果显示为强烈的HHNBV阳性，表明此组核酸探针在对虾杆状病毒的检测、对虾暴发性流行病的诊断和抗特种病原对虾育种等方面具有很高的应用价值。

荧光光谱法研究抗癌药物与DNA的相互作用

荧光探针技术可以用来测定药物核酸相互作用的强度。通过药物与核酸相互作用,使DNA与探针键合的程度减小,反映在探针荧光光谱的改变,从而可以了解药物和核酸的作用机理。相互作用常数D为DNA+探针中加入药物后探针的荧光强度相对于DNA+探针荧光强度减去纯探针荧光强度的下降百分数。文章利用盐酸小檗碱(Berberine)作为探针,测定几种抗癌药物加入DNA与荧光探针(盐酸小檗碱)混合溶液的荧光谱,探讨它们与DNA的相互作用。并根据相同浓度的不同药物与核酸相互作用的常数D确定作用强弱。

二茂铁标记DNA电化学探针的研制及性质研究

以乙基 -( 3-二甲基丙基 )碳化二亚胺盐酸盐 ( EDC)为偶联活化剂 ,利用缩合反应分别将电化学活性物质氨基二茂铁 ( Aminoferrocene,AFC)和醛基二茂铁 ( Ferrocenecarboxaldehyde,FCA)成功地标记在变性小牛胸腺 DNA片段上 ,制备成二茂铁标记 DNA探针 .分别采用电化学、紫外、红外光谱等方法研究了二茂铁标记 DNA探针的性质 ,计算了二茂铁的标记效率 ,变性小牛胸腺 DNA的反应效率以及二茂铁化合物与变性小牛胸腺 DNA的反应比率 .实验表明 ,氨基二茂铁和醛基二茂铁与 DNA上的磷酸基是以 1∶ 1比率进行的反应 ,该标记反应不影响 DNA链碱基的紫外吸收 ,二茂铁标记 DNA探针在石墨电极上有良好的电化学响应 .将制备好的二茂铁标记 DNA电化学探针置于冰箱中冷冻 (温度低于 -1 5℃ )保存 3个月后用于测定 ,峰电流仅下降 1 .

基于硫化镉纳米团簇标记DNA电化学传感的研究

合成了表面具有自由羧基的硫化镉 (CdS)纳米团簇 ,以乙基 (3 二甲基丙基 )碳二亚胺盐酸盐 (EDAC)为偶联活化剂 ,将其标记于人工合成的 5′端氨基修饰的寡聚核苷酸 (ODN)片段上 ,制备成CdS纳米团簇标记DNA探针 ,该寡聚核苷酸片段与大肠杆菌肠毒素基因相关 .在一定的条件下 ,使其与固定在玻碳电极表面的待测DNA序列进行杂交反应 ,利用阳极溶出示差脉冲伏安法 (ASDPV)间接测定Cd(II)的量 ,实现对互补、非互补DNA片段的识别和电化学检测 。

尖锐湿疣人乳头瘤病毒的基因分型

目的 检测尖锐湿疣中人乳头瘤病毒 (HPV )的基因型别。方法 用通用引物进行聚合酶链反应 ,扩增尖锐湿疣中HPVDNA ,用生物素标记的特异性基因分型探针 ,对聚合酶链反应扩增后的HPVDNA进行斑点杂交。结果 5 0例尖锐湿疣标本经PCR扩增后 48例HPVDNA阳性 ,阳性标本中HPV 6、11、16、18型的检出率分别为 16.7% ( 8/48)、3 7.5 % ( 18/48)、14 .6% ( 7/48)、4.2 % ( 2 /48) ,多重型别检出率为 2 2 .9% ( 11/48)。结论 HPV11型感染是尖锐湿疣发病的首要原因。

PCR结合分子杂交法检测鸡传染性支气管炎病毒

利用逆转录－ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）特异性扩增鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）基因组中Ｍ基因和Ｎ基因之间一段核酸片段。以ｐＵＣ１９质粒载体将此片段克隆，用ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切此重组质粒，回收克隆片段后，制成生物素标记的核酸探针。用ＲＴ－ＰＣＲ及生物素核酸探针法分别对ＩＢＶ，ＩＢＤＶ，ＩＬＴＶ，ＭＤＶ及ＮＤＶ进行检测，结果证明该方法为ＩＢＶ特异性检测方法。对人工感染ＩＢＶ的ＳＰＦ鸡口腔棉拭样品进行跟踪检测，证明本方法能在ＳＰＦ鸡接毒后１～１０ｄ内检出ＩＢＶ。

斑点杂交法测定Vero细胞DNA残留量的探针选择

目的:为精确检测以Vero细胞为基质的生物制品中宿主细胞残余DNA含量。方法:将提取的Vero细胞DNA分别用不同时间的超声波和 HindⅢ内切酶进行断链处理,电泳和序列分析并确定DNA片段长度,地高辛标记后制备成检测探针,测定已知的不同浓度的样品DNA和疫苗中DNA残留量。结果:HindⅢ内切酶处理断链后产生172 bp、344 bp、516 bp、688 bp不同长度的DNA,并选取172bp长度的DNA片断和超声波处理30 s的DNA长度为500～750 bp的DNA片断作为检测用探针。结论:两种方法处理的DNA探针检测DNA的灵敏度可达0.1 pg,重复性均较好,超声波处理的探针特异性优于酶切探针,并能成功的应用于疫苗产品中残余宿主细胞DNA的检测。

原位杂交技术鉴定马尔尼菲青霉

目的 探讨原位杂交技术 (ISH)特异性检测马尔尼菲青霉 (Pm)感染组织标本的可行性。方法 以Pm的rDNA区间种特异性序列作为特异性探针 ,通过聚合酶链反应 (PCR)扩增合成并以地高辛标记 ,与 12例临床确诊的Pm感染组织标本中的靶DNA杂交。结果 12例Pm感染标本中全部阳性 ,其它种属真菌感染组织均为阴性。结论 ISH技术可以灵敏、特异地检测出组织中的Pm ,适用于今后临床组织标本中Pm感染的检测。

溴化乙锭标记DNA电化学探针的研究

以乙基 -( 3 -二甲基丙基 )碳化二亚胺盐酸盐 ( EDC)为偶联活化剂 ,将电化学活性物质溴化乙锭( Ethidium bromide,EB)成功地标记在人工合成的含有 2 1个碱基的寡聚 DNA片段上 ,制备成 EB标记 DNA探针 ;用电化学方法将待测样品 DNA片段固定在石墨电极表面 ,在一定的温度、p H值和离子强度条件下与EB标记 DNA探针进行杂交反应 ,从而对靶序列 DNA片段进行识别和测定 .此外 ,还讨论了该探针的电化学性质、荧光光谱、待测 DNA片段在石墨电极表面的电化学固定、 DNA链碱基长度对 EB标记 DNA电化学探针的影响以及探针的选择性、重现性和寿命 。

虫草素与DNA作用的光谱研究

利用紫外光谱及以溴化乙锭 (EthidiumBromide ,EB)为荧光探针 ,研究了虫草素与小牛胸腺DNA的作用机理。讨论了不同浓度虫草素与DNA作用的紫外光谱 ,荧光光谱及磷酸盐对荧光的猝灭作用。从紫外光谱图上可看出DNA发生了明显的增减色效应并有轻微的红移现象 ,说明虫草素可能以其腺嘌呤碱基嵌入到DNA双螺旋碱基对间。DNA的荧光光谱先是增强然后减弱 ,最终伴随轻微的蓝移进一步表明了虫草素可能插入DNA双螺旋碱基对间。同时磷酸盐的猝灭作用说明虫草素与DNA的磷酸集团也能发生作用。最后通过Scatchard方程作图证明 :虫草素与DNA可能存在两种作用方式即插入方式和与DNA的磷酸基团结合。

荧光法研究手性金属配合物与DNA的作用机理

以溴化乙锭为荧光探针，研究手性金属配合物［Ｎｉ（ｐｈｅｎ）３］（２＋）和［Ｆｅ（ｐｈｅｎ）３］（２－）与ＤＮＡ的反应机理，结果表明，配合物与ＤＮＡ作用存在插入和静电结合两种模式，即部分菲咯啉配体插入ＤＮＡ双螺旋碱基对中，同时带正电荷的配合物与ＤＮＡ的磷酸基团发生静电结合。