伴有人线粒体DNA11778位点突变的Leber氏病家系综合分析

目的 为了探讨人线粒体mt-DNA11778位点突变对Leber氏病的发病影响及其临床特点。方法 采用等位基因特异聚合酶链反应 (PCR)方法检测了 2 0例临床拟视神经萎缩疾病患者的mt -DNA11778位点突变 ,并对其中mt -DNA11778位点突变的 6例患者进行家系调查。结果 临床拟视神经萎缩疾病患者的mt-DNA11778突变率为 30 % ,6个Leber氏病患者的母系亲属四代 4 2人家系调查中 ,共有 12个患者 ,临床患病外显率 2 8 6 % (12 / 4 2 ) ,其中男性 14人 ,患者 7人 ;女性 2 8人 ,患者 5人 ,男女性患病外显率分别为 5 0 0 % (7/ 14 )和 17 9% (5 / 2 8) ,男女性患病比率 1 8∶1,男性高于女性 ;6个家系中 ,2个家系有患病家族史 ,4个家系没有患病家族史 ;发病多在青少年期 ,患者母系亲属突变率为 10 0 %。结论 Leber氏病是典型母系遗传病 ,临床存在散发患者 ,检测mt-DNA11778位点突变有助于Leber氏病的确诊 ;mt -DNA11778位点突变者的临床外显率为 2 8 6 % ,男性患病风险高于女性且预后较差。

遗传性共济失调线粒体DNA11778、8344点突变的研究

目的:探索线粒体DNA点突变与遗传性共济失调的关系。方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增临床确诊为遗传性共济失调的26例患者和35例健康对照组外周血白细胞的线粒体DNA,并对PCR产物进行单链构象多态性(SSCP)分析。结果:所有对象均未检测到点突变。结论:遗传性共济失调的发生、发展可能与该区域点突变无关。

非综合征家族性耳聋线粒体DNA1555^(A→G)点突变分析

分析我国的非综合征家族性耳聋是否存在线粒体DNA1555A→G点突变。方法以PCR－RFLP的方法对3个非综合征耳聋家系进行线粒体DNA1555A→G点突变筛查。结果一个非综合征耳聋家系中5人中4人产生该突变。结论线粒体DNA1555A→G点突变是部分非综合征耳聋的致病原因之一。

线粒体DNA3243、3316、3394位点突变与精神分裂症相关分析

目的分析线粒体tRNALeu(UUR)基因3243位点及ND1基因3316、3394位点突变对精神分裂症(SZ)发病的影响。方法采用PCR扩增、限制性内切酶消化、琼脂糖凝胶电泳分型检测、DNA测序等方法,对随机抽取的无亲缘关系的250例患者(SZ组)和292例对照组的外周血mtDNA进行3243、3316和3394位点的突变检测。结果在SZ组中发现8例3316G/A突变,对照组中3例,两组相比差异无统计学意义(P=0.138)。在SZ组中发现15例3394T/C突变,对照组中有4例,两组相比差异有统计学意义(P=0.007)。在精神分裂症患者组和对照组中均未发现3243A/G突变。结论 mtDNA3394T/C突变可能与SZ发生有一定关系,mtDNA 3243A/G、3316G/A突变可能与SZ发生无关。

线粒体DNA点突变与心肌病关系的研究

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）和异源双链（ＨＥＴ）凝胶电泳检测了１５例原发性扩张型心肌病（ＤＣＭ）、１３例急性心肌炎患儿及１个肥厚型心肌病（ＨＣＭ）家系中１７例成员的外周血线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）点突变。结果显示，ＤＣＭ患儿中，６例在ｍｔＤＮＡ保守区３１０８～３７１７位存在点突变，其中１例家族性ＤＣＭ患儿及其母亲均检出点突变，提示ｍｔＤＮＡ点突变在ＤＣＭ发病中起一定作用；１３例急性心肌炎患儿中有１例发现ｍｔＤＮＡ点突变；其他心脏病患儿均未发现点突变；

甲基丙烯酸环氧丙酯致人支气管上皮恶性转化细胞DNA修复基因点突变的研究

背景与目的:研究甲基丙烯酸环氧丙酯(glycidyl methacrylate,GMA)致人支气管上皮(16HBE)恶性转化细胞DNA修复基因点突变情况。材料与方法:采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)检测GMA致16HBE恶性转化细胞DNA修复基因hMSH2、XRCC1、XPD及XRCC3的重要位点的突变情况,并以DNA测序方法加以验证。结果:16HBE细胞hMSH2IVS12-6(T>C)位点发生了突变,由野生基因型TT型突变为TC基因型,其它位点未检测到突变。DNA测序结果相符。结论:错配修复基因hMSH2IVS12-6(T>C)位点的突变可能为GMA诱导人支气管上皮细胞恶性转化过程中的重要起始分子事件之一。

散发性视神经炎的线粒体DNA 11778位点检测

Leber病系线粒体DNA基因突变引起的母系遗传性疾病,有家族史者易诊断.现将一组散发性视神经炎患者进行mt-DNA 11778位点突变检查,结果报告如下. 1 资料与方法 1.1 资料散发性原因不明的视神经病变21例,男性15例,女性6例,发病年龄在11～20岁16例,21～25岁3例,26～30岁1例,35岁1例.双眼20例,单眼1例.急性球后视神经炎4例,急性视神经乳头炎2例,视神经萎缩15例.视力0.06～0.1者16例,0.2者3例,0.4者2例;RAPD阳性14例;眼底呈程度不等视神经萎缩15例;眼底无异常4例;有视乳头充血,境界不清等2例;视野检查者18例,其中12例有中心暗点,5例有亚铃状暗点,10例周边视野缺损超过30°.

荧光探针法检测Leber遗传性视神经病变11778位点突变的研究

背景Leber遗传性视神经病变（LHON）与视神经炎的病因和治疗方法均不相同，但由于其临床表现相似，因此易被误诊。利用实时荧光定量PCR技术建立一种高通量、简便、快速、特异性高的LHON检测方法具有重要的临床意义。目的建立以实时荧光定量突变特异性Taqman探针技术检测LHON线粒体DNA（mtDNA）11778G〉A突变的方法，实现快速、简便、准确地筛查mtDNA11778位点突变LHON患者。方法根据mtDNA全基因组序列设计针对mtDNA11778G〉A突变的特异性Taqman探针和引物，从河南省眼科研究所分子生物室LHONDNA库任意选取标本84份，另抽取40名18～20岁健康体检者的血样40份作为正常对照，分别用实时荧光定量特异性探针法和序列测定法检测LHONmtDNA11778G〉A突变，并对检测方法进行可靠性验证。结果用实时荧光定量Taqman探针法检测mtDNA11778G〉A突变，84例视神经病变患者中发现mtDNA11778G〉A突变者23例，阴性结果者61例，23例阳性患者样本扩增曲线结果显示ct值为22．993±0．708，正常对照组样本ct值均为0，与直接测序法检测结果完全相符，其符合率为100％，未发现假阳性和假阴性结果者。结论用实时荧光定量突变特异性Taqman探针法检测LHONmtDNA11778G〉A突变位点的方法简单、省时、准确、直观、特异性强、敏感度高，适用于对LHONmtDNA11778G〉A突变的大规模筛查或预防性检查。

线粒体DNA tRNALeu(UUR)基因A3243G点突变糖尿病病人的监测

①目的 调查青岛地区糖尿病人群中线粒体DNAtRNALeu(UUR)基因np32 4 3A→G点突变糖尿病流行情况 ,评价所用方法检测该点突变的灵敏度。②方法 制定调查入选条件 ,选择可疑病例。由外周血白细胞提取基因组DNA。基因检测采用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)技术。③结果 糖尿病病人中该点突变检出率为 5‰ ,在可疑病人中为 14‰ ,在高危人群中为 2 0 0‰。通过增加电泳上样量可以检测到 7%的突变比例。④结论 该点突变在糖尿病人群中有一定流行。高危人群检出率高 ,提示对线粒体基因突变糖尿病的高危人群进行基因诊断非常必要。PCR

食管癌点突变型DNA聚合酶β与绿色荧光蛋白重组表达载体的构建

目的 构建携带食管癌点突变型DNA聚合酶β基因的重组真核绿色荧光蛋白表达载体p EGFP-C3- polβ。方法 运用PCR方法,从质粒pc DNA3.1- polβ中扩增出点突变型的DNA聚合酶β基因,作为目的片段,T- A克隆至p GEM- TEasy载体,再定向克隆至p EGFP- C3真核绿色荧光蛋白表达载体,重组质粒p EGFP- C3- polβ用限制性内切酶酶切和通用鉴定引物PCR扩增鉴定,并进行DNA序列分析。结果 DNA序列分析证实了重组载体中的DNA聚合酶β序列与已知的点突变型DNA聚合酶β基因序列相符。结论 成功构建了携带食管癌点突变型DNA聚合酶β基因的重组的荧光蛋白表达载体p EGFP- C3- polβ,为DNA聚合酶β基因的体内外表达及蛋白定位提供了理想的标记。

Leber遗传性视神经病变线粒体DNA原发性突变位点的分析

目的探讨Leber遗传性视神经病变(LHON)线粒体DNA原发性突变特征。方法利用Pyrosequencing和测序技术对11个LHON家系的13例典型患者及其30位家系成员11778G>A等12余种线粒体DNA突变位点进行分析。结果本地区LHON患者均为线粒体DNA同质性突变(homoplasmy)。11个LHON家系中有7个分别含有11778G>A,14484T>C和3460G>A原发性突变位点,占63.6%(7/11例)。13例患者线粒体DNA突变以11778G>A为主(53.8%,7/13例)。13708G>A和3552T>A突变单独存在于2个LHON家系中。3460G>A与3394T>C合并存在。未发病家系成员中可见11778G>A,14484T>C,13708G>A纯合性或杂合性突变体。结论继发性突变位点可单独存在,也可与原发性突变位点合共同导致LHON的发病。11719 G>A可能成为人线粒体有用的生物标签。

LDR结合毛细管电泳技术用于检测母体血浆中胎儿父系DNA点突变的可行性研究

目的：研究DNA连接酶检测反应（LDR）技术结合毛细管电泳用于检测母体血浆中胎儿父系DNA点突变的可行性。方法：将Cy5荧光标记的LDR引物稀释成0.1-500fmol,用毛细管电泳技术（CEQ8000型遗传分析仪）检测稀释引物;然后以β地中海贫血IVS-Ⅱ-654（C→T）突变为例,将含该突变不同浓度的扩增产物为LDR模板,用LDR技术特异地识别突变,其中LDR一侧引物用Cy5荧光标记,最后用毛细管电泳技术检测连接产物。结果：遗传分析仪检测Cy5荧光标记的LDR引物灵敏度至少达到0.1fmol;该分析仪能检测含0.1fmol IVS-Ⅱ-654（C→T）突变的扩增产物为模板的LDR产物,产物峰面积随模板浓度增加而增加,而且未检测到以1000fmol无IVS-Ⅱ-654（C→T）突变的扩增产物为模板的LDR产物。结论：PCR/LDR结合毛细管电泳技术用于检测低丰度基因点突变有很高的灵敏度,有望用于检测母体血浆中胎儿DNA点突变,从而可能大大拓展母体血浆中胎儿DNA在无创性产前诊断中的应用范围。

基于DNA聚合酶I的新型电化学传感器及其胰腺癌K-ras基因点突变检测

本文构建DNA聚合酶Ⅰ的新型DNA电化学传感器，将捕获探针通过Au—S键固定于Au基底表面，与互补靶序列杂交至点突变前一个碱基，通过DNA聚合酶Ⅰ将dUTP-biotin连接在目标DNA的检测位点。再与avidin-HRP反应，而后测定在TMB溶液中的电化学特性．结果表明，DNA电化学传感电极的检测电流值与K-ras突变型基因浓度（1．0×10^-15～1．0×10^-10mol·L^-1）对数呈良好的线性关系，且灵敏度高，特异性较佳．

缺血性卒中患者线粒体DNA点突变研究

对 5 6例缺血性卒中患者及 3 8例正常对照者检测线粒体 (mt)的 A3 2 43 G和 G13 5 13 A点突变 ,提取外周血淋巴细胞总 DNA。经热启动聚合酶链反应扩增线粒体相关的 DNA片段。Apa I酶切后电泳检测长度片段多肽 (RFL P) ,采用敏感性较高的非放射性银染单链构象多态性 (SSCP)技术分析扩增产物。结果显示 ,7例患者SSCP出现额外条带 ,具有显著性差异 (Fisher确切概率法 ,P=0 .0 3 9)。在 2例患者中检出 mt DNA A3 2 43 G突变 ,未见 G13 5 13 A点突变 Apa I酶切片段的长度片段多态性显示 ,A3 2 43 G突变率较低 (3 .5 7% )。

稳定表达点突变型DNA聚合酶β的细胞系的建立

目的 建立稳定表达点突变型DNA聚合酶 β的细胞系。 方法 将已构建的点突变型DNA聚合酶 β的真核表达载体用脂质体法转染中国仓鼠卵巢细胞 ,经G418筛选后得到稳定转染的细胞株 ,用RT_PCR方法鉴定点突变型DNA聚合酶 βmRNA水平的表达。结果与结论 建立稳定表达DNA聚合酶 β的细胞株 ,为进一步研究突变的DNA聚合酶

山西地区HBV DNA定量、分型及P区耐药突变点245例分析

目的:了解山西地区乙型肝炎病毒基因型分布、探究基因型和HBV DNA定量及P区耐药突变点相关性。方法:采用荧光定量PCR、聚合酶链反应-酶联免疫吸附试验(PCR-ELISA)和DNA测序技术分别对患者HBV DNA含量、HBV基因型和HBV P区耐药突变点进行了检测。结果:245例患者中B型45例(18.4%),C型187例(76.3%),BC混合型13例(5.3%);C型的血清中HBV-DNA平均含量2.7×106 IU/mL,B型的血清中HBV-DNA平均含量为6.4×104 IU/mL,二者达到了显著性差异;其中对60例HBV-DNA水平在104 IU/mL患者血清进行DNA测序检测结果发现,其中34例患者中没有出现耐药,在26例耐药患者中以拉米夫定+恩替卡韦+替比夫定交叉耐药比例最高,突变点主要为rtL180M、rtA181T和rtM204I/V。结论:山西地区HBV基因型以C型为主,B型次之,C型HBV DNA含量显著高于B型,且耐药的产生主要以拉米夫定+恩替卡韦+替比夫定交叉耐药为主。

遗传性共济失调线粒体DNA3243、8993点突变的研究

目的研究线粒体DNA点突变与遗传性共济失调(HA)的关系。方法采用聚合酶链反应方法,扩增26例HA患者和35例健康对照者的外周血白细胞线粒体DNA,用限制片断长度多态性分析法检测有无A3243G、T8993G或T8993C点突变。结果所有HA患者和健康对照者均未检测到线粒体DNA点A3243G、T8993G或T8993C点突变。结论线粒体DNAA3243G、T8993G或T8993C基因突变导致HA的可能性不大。