pcDNA3.1-GFP-LC3B真核表达载体的构建

[目的]构建含GFP-LC3B基因的真核表达载体。[方法]从HEK293细胞中提取总RNA,以反转录得到c DNA为模板,根据Gen Bank公布的人源LC3B基因序列设计引物,通过PCR方式扩增目的基因,将基因和pc DNA3.1-GFP载体双酶切后,通过T4连接酶将基因连接到pc DNA3.1-GFP载体上,得到pc DNA3.1-GFP-LC3B真核表达载体。[结果]扩增出目的基因,构建了含目的基因的真核表达载体pc DNA3.1-GFP-LC3B。[结论]成功构建了含有人LC3B基因的真核表达载体pc DNA3.1-GFP-LC3B,为研究细胞自噬提供了基础。

重组真核表达载体pcDNA3.1-Annexin A2的构建与鉴定

目的构建含Annexin A2目的基因的重组表达质粒。方法从鼻咽癌CNE-2细胞提取总RNA,RT-PCR扩增目的基因片段,经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后与pc DNA3.1(+)真核表达载体连接,构建真核表达载体pc DNA3.1-Annexin A2,转化DH5α,筛选阳性重组子,抽质粒进行KpnⅠand XbaⅠ双酶切、PCR和测序鉴定。结果重组质粒经PCR和酶切后都获得与RT-PCR大小相同的产物,长度约为1020b P,测序结果与基因库一致。结论成功构建重组真核表达质粒pc DNA3.1-Annexin A2。

构建PDCD5基因真核表达载体及电转染BGC823细胞的研究

目的构建PDCD5基因真核表达载体,并电转染BGC823细胞,获得稳定转染细胞。方法设计合成PDCD5基因片段,将其插入经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切的pcDNA3.1^+表达载体,菌落PCR和基因测序进行鉴定。重组质粒电转染BGC823细胞,G418筛选数周后PCR鉴定稳定转染细胞。结果重组质粒经菌落PCR测序分析表明,PDCD5基因序列准确插入预期位置,且序列正确。重组质粒成功电转染BGC823细胞,并整合入细胞基因组DNA。结论成功构建了PDCD5基因真核表达载体,并整合进BGC823细胞基因组,为研究PDCD5基因的功能及胃癌的基因治疗提供实验基础。

VEGF111b的表达载体构建及抗体制备

目的克隆VEGF111b基因,构建真核表达载体pc DNA3.1-VEGF111b,并进行测序,制备VEGF111b多克隆抗体。方法丝裂霉素C诱导处理卵巢癌SKOV3细胞24 h,设计VEGF111b酶切引物,以SKOV3细胞的c DNA为模板,通过PCR得到VEGF111b特异性基因产物,克隆入真核表达载体pc DNA3.1中,获得重组真核表达载体pc DNA3.1-VEGF111b,测序验证。用KLH耦联VEGF111b特异性短肽,制备多克隆抗体,Western blot检测其特异性。结果成功扩增了VEGF111b基因,双酶切、测序鉴定证实目的基因成功克隆到真核表达载体pc DNA3.1中,测序结果与预测完全一致,成功制备了VEGF111b多克隆抗体,使用其多克隆抗体,Western blot能够检测到VEGF111b对应分子量的蛋白条带。结论本研究鉴定了pc DNA3.1-VEGF111b真核表达载体,并验证了VEGF111b多克隆抗体的特异性,为进一步研究VEGF111b蛋白的功能奠定了基础。

成纤维细胞激活蛋白及其突变体真核表达质粒的构建及鉴定

目的 构建并鉴定人成纤维细胞激活蛋白（FAPα）真核表达质粒pc DNA-w FAPα（野生型FAPα）、pc DNA-t FAPα（胞外段FAPα）和pc DNA-m FAPα（缺失624~704位氨基酸的突变型FAPα）。方法 以口腔癌组织总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增w FAPαc DNA基因片段,连接至真核表达质粒pc DNA3.1（＋）获得重组pc DNA-w FAPα质粒。以重组pc DNA-w FAPα为模板,扩增t FAPα基因片段;用overlap PCR技术,获得m FAPα基因;分别连接至pc DNA3.1（＋）获得重组pc DNA-t FAPα和pc DNA-m FAPα质粒。结果 酶切鉴定和测序验证皆显示pc DNA-w FAPα、pc DNA-t FAPα和pc DNA-m FAPα为正确重组质粒。结论 成功构建人野生型FAPα（w FAPα）、胞外段FAPα（t FAPα）和突变型FAPα（m FAPα）真核表达质粒,为进一步研究FAPα在口腔鳞癌发病过程中的分子机制奠定基础。