转化生长因子β2真核表达载体pcDNA3.1(+)/TGF-β2的构建及其在骨髓基质细胞的表达

目的 :构建人转化生长因子 β2的真核表达载体 pcDNA3.1(+) /TGF - β2 ,检测其转染骨髓基质细胞后的表达。方法 :用PCR方法从人胎盘cDNA文库DNA中扩增TGF - β2全长cDNA ,该基因片段两端设计了NheⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点。将所得片段连接到T载体上测序证实。利用重组DNA技术将TGF - β2的cDNA构建到真核表达载体 pcDNA3.1(+)上 ,酶切鉴定。通过脂质体介导的转染技术 ,将所构建的载体导入从骨髓中分离培养的基质细胞中 ,体外单层培养。分别于转染后 2 4h和 4周利用RT -PCR和Western -Blotting方法检测目的基因的表达情况。结果 :经琼脂糖凝胶电泳及测序证实 ,PCR获得的片段与GenBank中登记的TGF - β2cDNA序列完全相同。pcDNA3.1(+) /TGF - β2酶切片段的长度与理论大小相符。转染后不同时期的骨髓基质细胞在mRNA和蛋白质水平均可检测到TGF - β2的表达。结论 :pcDNA3.1(+) /TGF - β2真核表达载体构建成功 。

重组突变型DNA聚合酶β表达载体pcDNA3.1-polβ的构建

目的 :构建含突变型 polβ基因重组表达载体。 方法 :从食管癌标本中提取总RNA ,反转录合成cDNA ,克隆入 pCDNA3.1质粒。以通用鉴定引物PCR扩增、小量提取质粒酶切鉴定重组质粒 ,并进行测序。 结果 :测序结果证实重组载体中的外源片段序列与所选取的标本完全相符。结论 :成功构建了含突变型polβ基因重组表达载体 ,可应用于下游研究。

真核表达载体pcDNA3.1-MAGE-1的构建

目的:构建含MAGE-1基因的重组真核表达质粒。方法:用RT-PCR方法从人肝细胞肝癌组织中扩增出MAGE-1基因cDNA序列,克隆至pGEM-T载体,测序证实基因碱基序列无误后,再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了pcDNA3.1-MAGE-1重组质粒。结果与结论:RT-PCR获得长度为927bp的阳性产物,经T载体和pcDNA3.1(+)真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实真核表达质粒pcDNA3.1-MAGE-1构建成功。

牛DKK2基因pcDNA3.1表达载体的构建

DKK2基因是Wnt信号通路的关键抑制因子,在胚胎发育、颗粒细胞生成等过程中发挥重要作用。扩增了牛DKK2基因CDS序列,构建了DKK2基因pc DNA3.1真核表达载体;为进一步验证载体在细胞内的表达效果,将表达质粒瞬时转染CHO细胞,利用q RT-PCR和Western blot检测DKK2的表达情况。结果表明,在CHO细胞中转染DKK2基因的真核表达载体质粒,其m RNA和蛋白质表达量均显著上升,表明已成功构建了DKK2基因表达载体,为下一步开展DKK2基因功能研究奠定了基础。

pcDNA3.1(+)/人前脑啡肽原基因真核表达载体的构建

目前慢性疼痛及癌症晚期疼痛的治疗方法仍主要依靠三阶梯药物疗法,三阶梯药物中以外源性镇痛药吗啡为主,其不良反应大,成瘾性高,限制了其大量使用,因此研究新的镇痛药及新的镇痛方法成为最近研究的热点。20世纪50年代以来,人们着力于研究新的镇痛物质,之后内源性镇痛物质[1]的发现及基因克隆技术[2]的应用为开辟新的镇痛研究奠定了基础。

pcDNA3.1表达载体转染对细胞生长的影响

为了探讨真核表达载体转染对细胞生长的影响，通过脂质体介导将ｐｃＤＮＡ３．１（＋）表达载体ＤＮＡ转染鼻咽癌细胞系 ＨＮＥ１，Ｇ４１８筛选后，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定稳定表达细胞株，以 ＨＮＥ１细胞为对照，观察ｐｃＮＡ３．１（＋）／ＨＮＥ１克隆细胞的生物学特性；结果显示，在ｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ＨＮＥ１阳性克隆中，一株细胞克隆培养过程中发生自溶性死亡，一株细胞生长明显受到抑制，另一株细胞生长无明显影响，揭示在宿主细胞中ｐｃＤＮＡ３.１（＋）ＤＮＡ与宿主基因组ＤＮＡ发生了随机整合，从而表现不同的细胞生物学改变。

pcDNA3.1^+-HIF-1α载体的构建和初步表达鉴定

目的克隆和构建带人低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因真核表达载体pcDNA3.1+-HIF-1α。方法以大肠癌细胞株HT29的总RNA为模板,进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),获得HIF-1α的cDNA,克隆入T载体,测序证实后克隆入真核表达载体pcDNA3.1+,酶切鉴定重组子。将构建好的pcDNA3.1+-HIF-1α用脂质体法转入HEK293细胞,RT-PCR鉴定重组质粒的表达。结果扩增出HIF-1αcDNA全长,测序结果与Genbank记载完全一致,成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1+;建立了稳定的细胞株HEK293/pcDNA3.1+-HIF-1α。结论成功克隆和构建带人HIF-1α基因真核表达载体pcDNA3.1+-HIF-1α,并证明其能在真核细胞内表达。

pcDNA3.1-BMP-2真核表达载体构建及转染兔骨髓基质细胞的实验研究

目的 构建人骨形态发生蛋白2(BMP-2)真核表达载体,鉴定并转染兔骨髓基质细胞,为转基因治疗骨缺失疾病提供实验基础。方法 双酶切克隆载体将BMP-2目的基因与真核表达载体pcDNA3.1连接,免疫组化及Western blotting检测转染BMP-2基因骨髓基质细胞的表达效果。结果 成功构建BMP-2真核表达载体,转染骨髓基质细胞后,有BMP-2表达。结论 骨髓基质细胞经基因转染后可以表达BMP-2,为进一步实验研究提供基础。

pcDNA3.1-Bcl-2真核表达载体构建

目的克隆大鼠Bcl-2基因(B cell lymphoma)全长cDNA,构建含大鼠Bcl-2基因的重组真核表达质粒。方法采用RT-PCR的方法从大鼠脾脏组织中扩增全长Bcl-2cDNA,将扩增产物克隆至pMD18-T载体,测序证实后,再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了pcDNA3.1-Bcl-2重组质粒。结果RT-PCR获得长度为720bp的阳性产物,经T载体和pcDNA3.1(+)真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实真核表达质粒pcDNA3.1-Bcl-2构建成功。结论成功克隆了Bcl-2基因,并构建了pcDNA3.1-Bcl-2重组质粒,为进一步研究Bcl-2基因的功能及应用Bcl-2进行基因治疗奠定基础。

人pcDNA3.1-TPX2真核表达载体的构建与表达

目的:构建TPX2的真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并观察其在食管癌EC9706细胞中的表达。方法:在pQE-70-TPX2原核表达载体基础上,根据GenBank上提供的TPX2基因序列及测序结果,采用Primer Premier 5.0软件设计扩增TPX2基因编码区的引物序列,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切,与真核表达载体pcDNA3.1连接后转化感受态大肠杆菌JM109,并进行酶切分析和序列测定。将构建的质粒pcDNA3.1-TPX2体外转染EC9706细胞,进行稳定筛选。用Western blot鉴定基因的表达。结果:DNA测序和BLAST比对表明克隆的人TPX2基因序列正确,进一步酶切分析显示,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并在EC9706细胞中获得稳定表达。结论:TPX2基因真核表达载体的成功构建为后续研究TPX2基因在肿瘤细胞中的功能奠定了基础。

pcDNA3.1-mAFP真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

目的构建真核表达载体pcDNA3.1-mAFP,观察其在293肿瘤细胞中的表达情况。方法从Hepa1-6小鼠肝癌细胞中提取总RNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增小鼠甲胎蛋白(mAFP)基因编码区全长序列,测序确认后,插入到pcDNA3.1真核表达载体中,双酶切鉴定。用Lipofectamine脂质体将构建的重组载体转染293肿瘤细胞,检测AFP蛋白在293细胞中的表达情况。结果成功克隆了mAFP基因编码区全长序列,构建出重组真核表达载体pcDNA3.1-mAFP,脂质体转染后可检测到mAFP基因在293细胞中的表达。结论该研究成功构建了重组pcDNA3.1-mAFP真核表达载体,为进一步开展原发性肝癌的靶向性基因治疗奠定了基础。

pcDNA_(3.1)-成骨生长肽真核表达载体在骨髓基质干细胞中的表达(英文)

背景:成骨生长肽具有明显的促进成骨细胞增殖、分化、成熟的作用。目的:观察成骨生长肽基因转染兔骨髓基质干细胞后的表达及表达产物对骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的影响。方法:构建重组真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,并在脂质体介导下,将其导入兔骨髓基质干细胞。通过G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR方法检测成骨生长肽基因在骨髓基质干细胞内的表达,并观察转染pcDNA3.1-成骨生长肽后骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的情况。结果与结论:实验成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,转染pcDNA3.1-成骨生长肽的骨髓基质干细胞可见成骨生长肽mRNA的表达,同时羟脯氨酸的分泌水平增加,碱性磷酸酶活性增高。证实经pcDNA3.1-成骨生长肽转染的兔骨髓基质干细胞不仅可以表达成骨生长肽,而且具有向成骨细胞分化的特性。

pcDNA3.1/eIF5A真核表达载体的构建及其在真核细胞CCRF-CEM中的表达

目的:摸索真核细胞翻译启动因子5A(eIF5A)编码基因的合成、pcDNA3.1/eIF5A真核表达载体的构建及其在真核细胞CCRF-CEM中的表达。方法:用PCR合成eIF5A基因,将基因分别接在克隆载体pMD 18-T的EcoRⅤ多克隆位点上和真核表达载体pcDNA3.1的HindⅢ和EcoRⅠ的多克隆位点之间,构建eIF5A基因的克隆载体和真核表达载体,分别在大肠杆菌E.coliDH5α中转化并提取质粒,将真核表达载体pcDNA3.1/eIF5A的质粒提取后,用脂质体包合并转染真核细胞CCRF-CEM,用流式细胞仪对eIF5A的表达水平进行检测。结果:eIF5A在CCRF-CEM细胞中的表达水平为107.03,eIF5A在转染细胞CCRF-CEM/trans中的表达水平为114.27,表达升高。结论:本实验构建了pcDNA3.1/eIF5A真核表达载体,发现其在CCRF-CEM细胞中高表达。本实验结果将有助于探讨肿瘤治疗过程中的新靶标。

重组真核表达载体pcDNA3.1-Annexin A2的构建与鉴定

目的构建含Annexin A2目的基因的重组表达质粒。方法从鼻咽癌CNE-2细胞提取总RNA,RT-PCR扩增目的基因片段,经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后与pc DNA3.1(+)真核表达载体连接,构建真核表达载体pc DNA3.1-Annexin A2,转化DH5α,筛选阳性重组子,抽质粒进行KpnⅠand XbaⅠ双酶切、PCR和测序鉴定。结果重组质粒经PCR和酶切后都获得与RT-PCR大小相同的产物,长度约为1020b P,测序结果与基因库一致。结论成功构建重组真核表达质粒pc DNA3.1-Annexin A2。

pcDNA 3.1-AKR1B10真核表达载体的构建

从胰腺癌PaTu8988S细胞中提取总RNA,并克隆AKR1B10基因,构建pcDNA 3.1-AKR1B10真核表达载体。转化感受态大肠杆菌DH5α细胞,提质粒,酶切及测序鉴定,pcDNA 3.1-AKR1B10真核表达载体构建成功。

真核表达载体pcDNA3.1-3a的构建及其在神经母细胞瘤SK-N-SH细胞中的表达

目的在pcDNA3.1真核表达载体中构建表达融合myc/his标签的甲基化酶表达载体pcDNA3.1-3a,并在神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞中进行验证,以期获得可表达甲基化酶催化结构域的融合基因。方法以甲基化酶的pcDNA4.0-GBD-3a-myc/his质粒为模板,通过PCR的方法扩增获得融合有myc/his标签序列的目的区段--甲基化酶催化结构域3a,将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1;以EcoRⅠ、EcoRⅤ双酶切和PCR方法对构建的表达载体进行鉴定,并通过测序证明载体构建正确,同时检测甲基化酶3a在SK-N-SH细胞中的表达。结果通过PCR方法获得了含有甲基化酶催化结构域的真核表达载体pcDNA3.1-3a,并通过免疫印记方法验证了在神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞样品中用抗his标签抗体可以特异性识别目的蛋白。结论正确构建了甲基化酶表达载体pcDNA3.1-3a,其可在神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞中表达。

利用pcDNA3．1／TOPO~TA克隆构建ANNEXIN A2基因的真核表达载体

目的克隆人类ANNEXIN A2基因,构建其正义真核表达质粒。方法采用逆转录聚合酶链式反应技术,从人类正常肺组织中扩增出人类ANNEXIN A2基因的完整编码区全长序列,通过DNA重组技术将该基因重组于pcDNA3．1／TOPO(?)TA真核表达载体上,构建出人类ANNEXIN A2基因正义表达质粒。通过DNA 测序方法对重组表达质粒进行鉴定。结果通过测序分析证实,构建的重组表达质粒目的基因片段为人类 ANNEXIN A2基因的完整编码区1 032 bp。结论构建真核表达载体的方法快速简便,适于进一步研究基因的细胞生物学作用。

基于西门利克森林病毒复制子的“自杀性”DNA疫苗载体的构建及其体外表达特性

对西门利克森林病毒(SFV)复制子质粒型表达载体pSFV1进行改造,即在SFV非结构蛋白(nSPs) 上游插入依赖于RNA聚合酶Ⅱ的人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子序列(hCMV IE Pro/Enh),同时在pS- FV1的多克隆位点下游插入SV40 poly(A)终止信号序列,获得可以完全在DNA水平上操作并具有自主复制功能的表达载体pSFV-DNA。为了进一步探讨改造载体的转染效率、表达能力以及是否能诱导细胞凋亡等特性, 将报告基因EGFP插入pSFV-DNA中亚基因组启动子下游,构建的重组表达质粒pSFV-EGFP转染BHK-21 细胞,转染后12 h即可观察到荧光,但转染效率明显低于直接由hCMV IE Pro/Enh驱动的EGFP真核表达质粒pEGFP-C1;提取转染后48 h的细胞基因组DNA,电泳发现pSFV-EGFP转染细胞均呈典型的DNA断裂(ladder),而pEGFP-C1转染细胞未观察到这种现象。上述结果表明:改造的载体不仅可完全在DNA水平上操作,而且能正确表达外源基因和诱导细胞凋亡,为开展各种病原微生物的“自杀性”DNA疫苗研究提供了良好的工具。