压应力对小鼠单核细胞RAW264.7 DNAX活化蛋白12、抗酒石酸酸性磷酸酶表达的影响

目的探讨压应力对小鼠单核细胞RAW264.7 DNAX活化蛋白12(DAP12)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)表达的影响。方法以小鼠单核细胞RAW264.7为研究对象,采用四点弯曲体外细胞加载装置加载压应力0、3、6、12h,分别以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹法检测DAP12、TRAP mRNA和DAP12蛋白的表达情况。结果小鼠单核细胞RAW264.7经破骨细胞培养液培养后,体积变大,核数目增多,TRAP染色阳性。受压应力刺激后,DAP12、TRAP mRNA及DAP12蛋白表达随加力时间延长而增加(P<0.05)。结论小鼠单核细胞RAW264.7经破骨细胞培养液培养后成功向破骨细胞转化,转化细胞受压应力刺激活化过程中存在DAP12高表达。

CDK12、STAT3在乳腺癌组织中的表达及与病理参数的关系

目的 探讨乳腺癌组织中细胞周期蛋白依赖性激酶12(CDK12)、信号转导及转录活化因子3(STAT3)表达情况及与病理参数的关系。方法 选取我院2016年1月至2019年12月收治的123例(均完成3年随访)女性乳腺癌患者为研究对象,采用免疫组化法检测乳腺癌组织和癌旁组织中CDK12、STAT3的表达情况。比较不同病理参数乳腺癌组织中CDK12、STAT3的表达情况,并分析CDK12、STAT3表达与病理参数及患者预后的关系。结果 乳腺癌组织中CDK12、STAT3阳性表达率均高于癌旁组织(P<0.05)。乳腺癌组织CDK12、STAT3阳性表达率:Ⅰ~Ⅱ期低于Ⅲ~Ⅳ期,无淋巴结转移低于有淋巴结转移;不同分化程度乳腺癌组织CDK12、STAT3阳性率差异显著(P<0.05)。乳腺癌组织中CDK12、STAT3阳性表达率与临床分期、淋巴结转移呈正相关,与分化程度呈负相关(P<0.05)。CDK12、STAT3阳性乳腺癌患者的3年生存率分别低于其阴性患者(P<0.05)。结论 乳腺癌患者组织中CDK12、STAT3呈现高表达,与乳腺癌的临床分期、淋巴结转移及预后有紧密关系,可作为临床判断病情、评估预后的有效指标。

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)生物学功能的结构基础

丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)是生物体内重要的信号转导系统之一 ,能对广泛的细胞外刺激发生反应 .蛋白激酶的空间构象是其功能的重要决定因素 .对MAPK蛋白结构的研究表明 ,MAPK的结构与功能之间具有密切的关系 .尽管MAPK各亚族的结构非常相似 ,但也存在着一些差异 ,这些差异是不同亚族对不同的细胞外刺激产生特异性反应的结构基础 .某些关键性结构 ,例如Loop12 ,在MAPK对上游激酶的作用、下游底物的选择以及亚细胞定位中都具有重要作用 .进一步深入研究MAPK的空间结构 ,探讨MAPK的生物学功能与其空间构象之间的关系 。

棕榈酸急性、慢性刺激对小鼠骨骼肌细胞腺苷酸活化蛋白激酶活性的影响

目的:探讨棕榈酸急性、慢性刺激对小鼠骨骼肌细胞腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)活性的影响。方法:以体外培养并诱导分化成熟的C2C12小鼠骨骼肌细胞为研究对象,观察棕榈酸急性(5-30 mins)或慢性(16 h)刺激对AMPK蛋白活性的影响。小鼠骨骼肌细胞AMPK蛋白磷酸化水平的测定采用免疫印迹法。结果:(1)棕榈酸急性刺激下,C2C12细胞AMPK蛋白活性水平成时间-浓度依赖性增加。其中当300μM棕榈酸刺激15分钟时,与对照组相比,AMPK蛋白活性水平显著增加(P<0.05);(2)与对照组相比,16 h棕榈酸慢性刺激可诱导C2C12细胞AMPK蛋白活性水平显著增加(P<0.05)。结论:棕榈酸急性、慢性刺激均能诱导骨骼肌细胞AMPK活性增加,可以为一次性或持续性高脂膳食引起的血浆游离饱和脂肪酸过多造成的骨骼肌胰岛素抵抗的在体研究,提供简便实用的骨骼肌细胞模型。

锰对PC12细胞的增殖抑制及其Erk1/2活化表达

目的 探讨锰在细胞丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路Erk1/2活化表达的作用及其相互之间的关系 ,研究其对基底神经节损伤作用的机制。方法 取对数生长期PC12细胞 ,用含 2 0 0、40 0、60 0、80 0 μmol/LMnCl2 的培养液 ,分别作用 1、2、3、4d ,噻唑蓝 (MTT)比色试验、平板集落形成实验和台盼蓝拒法筛选锰的细胞毒性剂量 ;免疫印记法 (Western blot)检测磷酸化Erk1/2 (p Erk2 )水平。结果 MTT和平板克隆形成实验检测结果显示 2 0 0～ 80 0 μmol/LMnCl2 作用 1、2、3、4d均对PC12细胞株有显著的抑制作用 ,且呈剂量和时间依赖效应关系 ,而且 60 0 μmol/LMnCl2 作用 4d对PC12的抑制率可达 5 0 %以上。Western blot结果显示 60 0 μmol/LMnCl2 作用 1、2、3、4d可见p Erk2逐渐降低 ,其中作用 2d时较对照明降低了 75 % (n =3 ,P <0 0 5 ) ,2 0 0、40 0、60 0 μmol/LMnCl2 分别作用 4d时 ,p Erk2亦逐渐降低 ,当 40 0 μmol/LMnCl2 作用 4d时较对照明降低了 78% (n =3 ,P <0 0 1)。结论 使用Erk通路MEK1/2特异性阻制剂PD980 5 9实验结果表明 :锰可能通过MEK1/2磷酸化下游的Erk1/2 ,下调p Erk。锰对PC12细胞的毒性作用可能是通过关闭胞外信号调节激酶(ERK)

葛根素对缺氧诱导PC12细胞神经损伤及JNK/MAPK信号通路的影响

目的探讨葛根素对缺氧诱导的大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞PC12细胞神经损伤及c-Jun氨基末端激酶(JNK)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的影响。方法体外培养PC12细胞,50 ng/ml神经生长因子(NGF)诱导分化,对高分化的PC12细胞进行缺氧处理,再对缺氧诱导的PC12细胞进行不同浓度(0.1、1.0、10.0μmol/L)葛根素处理,将细胞分为对照组,缺氧组,0.1、1.0、10.0μmol/L葛根素组,葛根素+JNK通路激活剂茴香霉素(AC)组。四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞活力;流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况;2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)法检测各组PC12细胞活性氧(ROS)水平;试剂盒检测各组细胞丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平;Western印迹检测各组凋亡蛋白JNK/MAPK信号通路相关蛋白表达情况。结果低分化PC12细胞多呈椭圆形,聚集成小团簇状;高分化PC12细胞长出类似神经元样突起,培养一段时间后,细胞体积增大突起增多增长,形成网络。与对照组比较,缺氧组PC12细胞活力、SOD水平显著降低,细胞凋亡率、细胞内ROS含量、MDA水平及蛋白p-JNK、caspase-3表达显著升高(P<0.05);与缺氧组比较,0.1、1.0、10.0μmol/L葛根素组PC12细胞活力、SOD水平显著升高,细胞凋亡率、细胞内ROS含量、MDA水平及蛋白p-JNK、caspase-3表达显著降低,且呈剂量依赖性(P<0.05);与10.0μmol/L葛根素处理组比较,葛根素+AC组细胞活力、SOD水平显著降低,细胞凋亡率、细胞内ROS含量、MDA水平及蛋白p-JNK、caspase-3表达显著升高(P<0.05)。结论葛根素能够保护缺氧诱导的PC12细胞神经损伤,可能与抑制JNK/MAPK通路的激活有关。

呼吸道合胞病毒毛细支气管炎患儿中TREM-1/DAP12通路关键信号节点的表达

目的探讨呼吸道合胞病毒(RSV)毛细支气管炎患儿中TREM-1/DAP12蛋白的表达及该通路与炎症反应的潜在关联。方法选取2017年1月—2019年1月四川省广安市人民医院RSV毛细支气管炎患儿作为病例组(分为轻症组和重症组),选取同期体检的健康儿童作为对照组,对血清中炎症因子含量及外周血单个核细胞(PBMCs)中TREM-1、DAP12表达进行检测。构建RSV感染人支气管上皮(NHBE)细胞的体外细胞模型,将人支气管上皮细胞(NHBE)分为对照组、RSV感染组、RSV+siRNA-Control组和RSV+siRNA-TREM-1组,并对细胞中TREM-1、DAP12的表达及上清液中炎症因子含量进行检测。结果轻症组、重症组儿童血清中白细胞介素-1β(IL-1β)等炎症因子含量、PBMCs中TREM-1、DAP12表达量均高于对照组,且重症组高于轻症组(均P<0.05)。RSV感染组、RSV+siRNA-Control组TREM-1、DAP12表达量均高于对照组、RSV+siRNA-TREM-1组(均P<0.05)。RSV+siRNA-TREM-1组上清液中炎症因子含量均低于RSV感染组、RSV+siRNA-Control组(均P<0.05)。结论TREM-1/DAP12信号通路在RSV毛细支气管炎患儿中高表达。RSV诱导NHBE细胞高表达TREM-1,沉默TREM-1可以下调DAP12表达,抑制炎症因子分泌。

白细胞介素-12抗NK/T细胞淋巴瘤的活性及其机制研究

目的研究白细胞介素-12(IL-12)的抗NK/T细胞淋巴瘤活性及机制。方法培养NK/T细胞淋巴瘤的YTS细胞株并分为对照组、IL-12组、NC siRNA组、JAK2 siRNA组、空白质粒组、JAK2表达质粒组,用含有0.625、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0 ng·mL^-1 IL-12的培养基处理或转染NC siRNA、JAK2 siRNA、空白质粒、JAK2表达质粒,检测细胞活力、细胞凋亡、细胞周期及细胞中JAK2及STAT3的表达;选择C57小鼠并建立移植瘤模型,随机分为对照组及IL-12组后,测定移植瘤质量及JAK2、STAT3的表达。结果在YTS细胞中,IL-12以及JAK2 siRNA能够抑制细胞活力、细胞周期及细胞中p-JAK2、p-STAT3的表达,诱导细胞凋亡(P<0.05);转染JAK2的表达质粒能够使20.0 ng·mL^-1的IL-12抑制细胞活力、细胞周期、细胞中p-JAK2、p-STAT3表达及诱导细胞凋亡的作用减弱;在移植瘤小鼠中,IL-12干预后,移植瘤质量及移植瘤中p-JAK2、p-STAT3的表达均明显下降(P<0.05)。结论IL-12具有抗NK/T细胞淋巴瘤的活性且其机制与抑制JAK2/STAT3信号通路的激活有关。

p38L12-TAT融合肽对山梨糖醇引起的ECV304细胞ATF2磷酸化的抑制作用

构建p38Loop12(L12)的TAT融合表达载体,纯化原核表达的p38L12融合蛋白并鉴定其在真核细胞内的功能.利用PCR方法分别扩增出p38L12及其“TXY”双磷酸化位点的AF突变体p38L12(AF)片段,克隆入His标记的TATEGFP融合蛋白原核表达载体pHTE(pET14bHisTATEGFP),经酶切、测序鉴定正确后,将重组质粒转化原核表达菌,诱导表达纯化融合蛋白;将融合蛋白加入ECV304细胞后于荧光显微镜下观察并行Western印迹分析,检测融合蛋白的细胞内转导活性;通过检测内源性ATF2磷酸化水平,鉴定高渗刺激下p38L12对内源性p38活性的影响.成功构建了p38L12和p38L12(AF)片段与TAT的融合表达载体,并获得相应的融合蛋白.在ECV304细胞中可见导入的HTEp38L12和HTEp38L12(AF)融合蛋白具有较高的细胞内转导活性和转导效率,并可竞争性抑制高渗刺激对内源性p38的活化.基于HIV1TAT细胞转导系统证实p38L12可竞争性抑制高渗刺激诱导的内源性p38对ATF2的活化,从而发挥对p38激活特异性抑制的功能.

ERK在NGF诱导PC12细胞分化中的作用

目的探讨细胞外信号调节激酶(ERK)在NGF诱导的PC12细胞分化中的作用机制。方法以NGF处理PC12细胞建立分化模型,运用免疫印迹检测不同浓度不同作用时间时NGF对ERK1/2蛋白和磷酸化ERK1/2蛋白水平的影响,并观察MAPK/ERK激酶(MEK)抑制剂U0126对NGF诱导的细胞形态学改变的影响。结果ERK1/2蛋白的磷酸化呈现NGF剂量和时间依赖性。NGF作用细胞5min即可观察到明显的ERK1/2蛋白磷酸化,持续1h左右,2h时降低到初始水平,而细胞形态的改变出现在NGF作用12h以后。倒置相差显微镜观察可见PC12细胞分化的程度与ERK1/2活化持续的时间正相关,U0126可完全即时抑制ERK1/2的活化,而ERK1/2活化的抑制可完全阻断NGF诱导的PC12细胞分化。结论ERK1/2的活化是PC12细胞发生分化的必需事件,其活化时间的长短对分化具有决定作用。

DHA对C2C12细胞成脂分化过程中相关基因表达的影响

采用胰岛素、地塞米松和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤联合诱导C2C12细胞分化为脂肪细胞,诱导分化后加入100 mmol/L二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)。DHA处理8 d后,收集细胞,提取总RNA,采用实时荧光定量PCR方法检测脂肪分化相关基因PPARγ、C/EBPα和ADD1转录表达水平。结果表明,C2C12细胞成脂分化时添加DHA能显著上调PPARγ、C/EBPα和ADD1基因的表达,并且联合添加维生素E后效果更显著。

p38介导油酸对小鼠c2c12细胞PGC-1α表达的影响

目的研究油酸(OA)对小鼠c2c12细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)表达的影响,探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在其中的作用。方法以不同浓度油酸及p38抑制剂SB203580(SB)分别处理c2c12细胞,逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测PGC-1αmRNA表达,WesternBlot检测PGC-1α蛋白表达。结果油酸处理组PGC-lαmRNA及蛋白表达明显高于对照组(P<0.05);OA+SB组PGC-1α表达减低(P<0.05)。结论油酸能促进c2c12细胞PGC-1αmRNA转录和蛋白的表达,该作用可能与p38 MAPK信号通路有关。

山奈酚通过抑制p38 MAPK通路减轻6-羟多巴胺(6-OHDA)诱导的PC12细胞炎症

目的研究山奈酚(KAE)对神经毒素6-羟多巴胺(6-OHDA)诱导的PC12细胞炎性损伤的保护作用,并探讨其是否与抑制p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)通路有关。方法将PC12细胞分为对照组、100μmol/L 6-OHDA处理组、6-OHDA联合(20、40、60、80、100)μmol/L KAE处理组、KAE组,培养24 h。倒置显微镜下观察PC12细胞的形态变化,CCK-8法检测细胞活力;在筛选出KAE的最佳作用剂量基础上,应用免疫细胞化学染色法检测环加氧酶2(COX2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、核因子κB(NF-κB)的表达,Western blot法检测COX2、iNOS、NF-κB蛋白水平。为探讨其作用机制,在PC12细胞的6-OHDA培养体系中分别给予KAE和p38 MAPK通路抑制剂SB203580,Western blot法检测iNOS、COX2、NF-κB、p38 MAPK、磷酸化的p38 MAPK(p-p38 MAPK)的蛋白水平。结果与对照组比较,6-OHDA组细胞数量显著减少,大部分细胞胞体皱缩,聚集成团;与6-OHDA组相比,6-OHDA联合(20、40、60、80、100)μmol/L KAE处理组细胞数量增多,形态明显改善,且KAE浓度为80μmol/L时,细胞形态最好、数量最多。6-OHDA处理组细胞COX2、iNOS、NF-κB表达明显增高;与6-OHDA组比较,6-OHDA联合80μmol/L KAE处理组上述分子的表达显著下降。6-OHDA组细胞的COX2、iNOS、NF-κB、p38 MAPK、p-p38 MAPK的蛋白水平明显升高,而在6-OHDA联合KAE组和6-OHDA联合SB203580组,以上蛋白表达水平较6-OHDA组显著降低。结论KAE抑制p38 MAPK通路减轻6-OHDA所致的PC12细胞损伤。

溴莫尼定对低氧诱导的PC12细胞神经损伤的保护作用

目的探讨溴莫尼定对缺氧诱导的PC12细胞神经损伤的保护作用及其机制。方法实验于2018年5月至2019年8月进行,建立缺氧诱导的大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤PC12细胞损伤模型,实验分为对照组、缺氧组(缺氧损伤)、缺氧+0.25µmol/L溴莫尼定组、缺氧+0.5µmol/L溴莫尼定组、缺氧+1µmol/L溴莫尼定组。采用MTT法检测各组细胞活力;流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;根据检测试剂盒测定乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛、超氧化物歧化酶(SOD)含量;蛋白质印迹法检测细胞中B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)及蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/信号转导及转录活化因子3(STAT3)信号通路相关蛋白表达。结果缺氧处理后,细胞活力较对照组降低[(0.35±0.04)比(0.69±0.08)](P<0.05),溴莫尼定不同剂量组细胞活力较Hypoxia组升高[(0.37±0.05)、(0.40±0.06)、(0.44±0.05)、(0.53±0.07)、(0.60±0.09)比(0.35±0.04)](P<0.05);Hypoxia组细胞凋亡率增加[(32.89±3.46)%比(3.58±0.34)%](P<0.05),溴莫尼定干预后细胞凋亡率降低[(7.41±0.75)%比(32.89±3.46)%](P<0.05),Bax蛋白表达量降低[(1.48±0.16比3.76±0.31)](P<0.05),而Bcl-2蛋白表达量升高[(0.89±0.12)比(0.29±0.04)](P<0.05);Hypoxia组细胞SOD含量较对照组降低[(50.43±5.36)U/mg比(173.39±18.21)U/mg](P<0.05),溴莫尼定干预后可提高缺氧诱导的细胞SOD含量降低[(143.28±15.43)U/mg比(50.43±5.36)U/mg](P<0.05);Hypoxia组细胞LDH[(62.31±6.82)U/mL比(19.07±1.65)U/mL]、丙二醛含量[(4.29±0.43)µmol/g比(1.35±0.12)µmol/g]较对照组增高(P<0.05),溴莫尼定处理后可降低缺氧引起的LDH[(31.35±3.21)U/mL比(62.31±6.82)U/mL]、丙二醛含量[(1.76±0.19)µmol/g比(4.29±0.43)µmol/g]增加(P<0.05);Hypoxia组细胞Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、STAT3、p-STAT3表达降低(P<0.05),溴莫尼定处理后可提高细胞Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、STAT3、p-STAT3的表达(P<0.05);抑制Akt/mTOR/STAT3信号通路可逆转溴莫尼定对缺氧诱导的PC12细胞增殖、凋亡及LDH、丙二醛、SOD水平的影响。结论溴莫尼定可通过激活Akt/mTOR/STAT3信号通路促进缺氧诱导的PC12细胞增殖、抑制细胞凋亡及增强其抗氧化能力进而对缺氧诱导的神经细胞损伤发挥保护作用。

P2Y12受体抑制剂对骨癌痛大鼠痛阈及脊髓p38丝裂原活化蛋白激酶表达的影响

目的研究脊髓P2Y12受体在大鼠骨癌痛中的作用及其对p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）表达的影响。方法雌性SD大鼠40只，用随机数字表法分为5组（n=8）：正常组（N）、假手术组（S）、DMSO溶剂骨癌痛组（DA）、骨癌痛组（A）、骨癌痛镇痛组（MA）。大鼠左胫骨上段注入经腹水培养的Walker256癌细胞建立骨癌痛模型。建模后第9—12天分别行鞘内注药，S组、A组注射0．9％生理盐水，DA组注射5％二甲基亚砜（DMSO）溶剂，MA组注射MRS2395（400pmol／μl，溶于5％DMSO溶液），容量各15μl。注药前后测试大鼠左后足机械痛阈值，术后第12天测完痛阈后取L4～6脊髓，采用免疫组化及免疫荧光法测定脊髓背角磷酸化p38MAPK（p—p38MAPK）表达水平。结果建模后第9天，与N组（36．1±4．0）g、S组（38．9±5．2）g比较，MA组机械性痛阈值下降为（19．8±5．0）g（P〈0．01），第12天p-p38MAPK表达增加（P〈0．01）。与DA组（17．7±3．0）g、A组（19．1±2．5）g比较，MA组鞘内给药后大鼠机械痛阈值增高，峰值为（26．5±4．7）g（P〈0．05）；与DA组（细胞数：43．4±3．8、IOD值：569±27）、A组（细胞数：45．0±2．6、IOD值：594±22）比较，MA组（细胞数：20．9±2．2、IOD值：246±25）第12天脊髓P—p38MAPK表达减少（P〈0．01）；但与N组、S组比较，MA组机械痛阈值仍低于正常（P〈0．01），脊髓p-p38MAPK蛋白表达高于N组（细胞数：9．9±2．4、IOD值：82±28）、S组（细胞数：10．9±2．2、IOD值：109±25）（P〈0．01）。免疫荧光双标显示脊髓背角p-p38MAPK与小胶质细胞共表达。结论鞘内注射P2Y12受体抑制剂MRS2395可能通过抑制脊髓背角的p38MAPK磷酸化程度部分减轻大鼠骨癌疼痛。

电磁辐射诱导PC12细胞凋亡中丝裂原活化蛋白激酶的差别激活

目的探讨丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导系统的差别激活与电磁辐射诱导PC12细胞凋亡的关系。方法以65mWcm2电磁波辐照离体培养PC12细胞20min,分为辐照后即刻及3、12、24h共4个观察时相点,采用流式细胞仪检测PC12细胞凋亡率,采用蛋白质免疫印迹法检测ERK12、JNK、P38MAPK蛋白质磷酸化水平。结果电磁波辐照后即刻PC12细胞凋亡开始增加;3h后凋亡细胞进一步明显增多,凋亡率约为23.5%;12h后细胞凋亡率与3h相比,差异无统计学意义(P>0.05);24h后细胞凋亡再次明显增加,并达到高峰。电磁辐射后PC12细胞ERK12和JNK蛋白质磷酸化都明显增加,但ERK12的增加持续到3h,JNK蛋白磷酸化水平增高一直持续到12h,24h后两者都较对照组明显降低。P38MAPK蛋白质磷酸化水平在辐照后一直处于较高水平,其变化趋势呈双峰状,即在3h和24h出现2次磷酸化高峰。结论电磁辐射可以激活MAPK信号转导系统,但ERK12、JNK、P38MAPK表现为差别激活。MAPK信号转导系统可能参与了电磁辐射诱导的PC12细胞凋亡,正是MAPK这种差别激活才导致PC12细胞出现特有的凋亡变化形式。

重组人白介素-12对辐射损伤脐带血造血干细胞凋亡及其胞内STAT5、STAT4和丝裂原活化蛋白激酶表达的影响

目的探讨重组人白介素-12(Recombinant human interleukin-12,rhIL-12)对辐射损伤新生儿脐带血造血干细胞凋亡及其胞内STAT5、STAT4和丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase,MAPK)表达的影响。方法收集16份新生儿脐带血,分离单个核细胞,经终浓度分别为0.01、0.1和1 ng/ml的rhIL-12处理24 h后,用直线加速器以4 Gy X射线单次照射24 h,用流式细胞仪分析CD34+造血干细胞的凋亡率;并观察CD34+造血干细胞经1 ng/ml rhIL-12体外活化15和30 min后,细胞内STAT5、STAT4和MAPK蛋白的表达水平。结果 rhIL-12对辐射损伤引起的新生儿脐带血CD34+造血干细胞凋亡具有明显的下调作用(P<0.01),且呈剂量依赖性(P<0.01);rhIL-12与新生儿脐带血CD34+造血干细胞共同孵育15和30 min,均可显著上调造血干细胞内STAT5和MAPK蛋白的表达水平(P<0.01或<0.001),下调STAT4蛋白的表达水平(P<0.05或<0.01),且均呈时间依赖性(P<0.001或<0.05)。结论 rhIL-12对辐射损伤的新生儿脐带血造血干细胞具有抗凋亡作用,并能上调造血干细胞内STAT5和MAPK蛋白的表达水平。

原因不明习惯性流产与IL-10、IL-12及抗活化蛋白C关系的研究

目的探讨原因不明习惯性流产与抗活化C(APCR)的发生及白细胞介素10、12(IL-10、IL-12)水平变化的关系。方法采用加与不加活化蛋白C(APC)的部分凝血活酶时间(APTT-APC)试验和酶联免疫吸附试验(ELISA),检测30例发生原因不明习惯性流产患者的APCR及其血清IL-10、IL-12水平,并与50例正常妊娠妇女比较。结果习惯性流产患者组APCR阳性率及其血清IL-12水平明显高于正常妊娠对照组(P<0.01),而其IL-10水平明显低于对照组(P<0.01),且血清IL-10和IL-12水平呈负相关性(r=-0.672,P<0.05)。结论APCR与习惯性流产的发病相关,同时当孕妇的辅助T细胞(Th)分泌IL-12升高,而IL-10分泌降低时,由于母胎的免疫平衡受到破坏,从而导致习惯性流产的发生。

AMPK、p38 MAPK信号通路参与调控电刺激诱导骨骼肌细胞PGC-1α基因表达

目的采用急性电刺激(acute electrical stimulation)C2C12成熟肌管细胞模型,结合使用相关信号激酶通路特异性抑制剂,探究急性电刺激所诱发的细胞内信号激酶对PGC-1α基因表达的调控作用。旨在从细胞水平揭示肌肉收缩刺激调控PGC-1α基因表达的分子机制。方法体外培养小鼠成肌细胞系C2C12细胞,采用脂质体法分别转染含小鼠PGC-1α启动子DNA全序列的质粒(p2533)及装载有能够与PGC-1α全长基因序列相结合GAL4DNA结合区域的p Bind载体,细胞在转染后分化5-6 d形成成熟肌管,5 Hz,10 V强度急性电刺激2 h后即刻收集各组细胞,进行总蛋白或双荧光素酶检测。抑制剂处理组分别采用40μM Compound C(CC,AMPK抑制剂)与10μM BIRB796(BIRB,p38抑制剂)处理细胞。结果与对照组(CON)相比,电刺激组(STIM)细胞PGC-1α启动子活性显著增高52%(P<0.05),PGC-1α辅激活转录活性显著增高35%(P<0.05),同时伴随PGC-1α蛋白由细胞质向细胞核迁移的现象。此外,与CON组相比,STIM组细胞AMPK、p38信号激酶通路磷酸化水平显著上调(P<0.05),在分别采用AMPK、p38抑制剂处理后,其磷酸化水平显著受到抑制(P<0.01)。结论急性电刺激可诱导骨骼肌细胞PGC-1α转录水平以及翻译后蛋白水平活性上调,这一作用部分是通过AMPK或p38信号通路实现的。

丝裂原活化蛋白激酶信号通路对软脂酸培养的肌细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子表达的调控作用

目的研究软脂酸对C2C12细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子(PGC-1α)表达的影响,揭示丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路与PGC-1α表达的关系,寻找软脂酸诱导C2C12细胞PGC-1α表达变化的上游调节通路。方法检测软脂酸培养的C2C12细胞PGC-1α、细胞外信号调节激酶(ERK)、jnk氨基末端激酶(JNK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)及其磷酸化蛋白phosp-38MAPK(P-p38MAPK)的表达变化。寻找发生变化的MAPKs信号通路,用筛选到的p38MAPK抑制剂进行干预,分为对照(Con)组、软脂酸(Palmitate)组、p38MAPK抑制剂组和Palmitate+p38MAPK抑制剂组,测定PGC-1α、p38MAPK总蛋白及其P-p38MAPK的表达。结果软脂酸培养的C2C12细胞PGC-1α蛋白表达下降,呈时间依赖性;ERK、phospho-ERK、JNK、phospho-JNK及p38MAPK表达无变化,P-p38MAPK表达升高。用p38MAPK抑制剂干预C2C12细胞,PGC-1α表达在Palmitate组最低,p38MAPK抑制剂组和Palmitate+p38MAPK抑制剂组较Palmitate组升高,p38MAPK抑制剂组最高。结论软脂酸诱导的PGC-1α表达下降可能由p38MAPK信号通路调控。