高亲和力重组人硫氧还蛋白还原酶的原核表达、纯化和初步活性鉴定

目的:分离纯化高亲和力的人硫氧还蛋白还原酶(TrxR)蛋白,完成初步的活性鉴定。方法:优化重组人TrxR蛋白的原核表达条件,再通过亲和层析法分离纯化得到高纯度的TrxR重组蛋白。采用5,5′-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DNTB)法比较重组人TrxR蛋白、商业化鼠肝提取TrxR蛋白以及重组人TrxR-ΔC蛋白的酶活力,并用TrxR特异性抑制剂金诺芬(Auranofin)分别检测其对三种蛋白的抑制效率。结果:优化了重组人TrxR蛋白的原核表达条件,得到高纯度目的蛋白。在8个测量时间点(120~330 s),TrxR的吸光度>pET-TRS TER>TrxR-ΔC(P<0.05)。TrxR和pET-TRS TER的抑制率随抑制剂浓度的减小而减小;TrxR-ΔC蛋白在抑制剂浓度0.00000477μmol/mL的活性低于其他10个浓度(0.01950~5.00000μmol/mL)(P<0.05);抑制剂在0.0000191μmol/mL浓度时蛋白活性低于抑制剂浓度为5.00000μmol/mL(P<0.05)。结论:获得高纯度、高活力的重组人TrxR蛋白,证明C端硒半胱氨酸是TrxR蛋白发挥活性的重要氨基酸。