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旋毛虫成虫DNaseⅡ—T3223-7基因的克隆及其表达特性鉴定 被引量:2
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作者 王安琪 丁静 +5 位作者 王楠 王兆国 胡晓祥 吴秀萍 刘明远 廖成水 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期87-91,共5页
利用RT-PCR技术从旋毛虫成虫得到T3223-7基因,并进行扩增克隆到原核克隆载体pMD18-T中,将重组质粒转入克隆菌DH5α,提取质粒进行酶切和测序鉴定,连接至pET-28a表达载体,最后转入表达菌Rosetta(DE3)。用1mmol/L IPTG诱导培养重组表达菌,... 利用RT-PCR技术从旋毛虫成虫得到T3223-7基因,并进行扩增克隆到原核克隆载体pMD18-T中,将重组质粒转入克隆菌DH5α,提取质粒进行酶切和测序鉴定,连接至pET-28a表达载体,最后转入表达菌Rosetta(DE3)。用1mmol/L IPTG诱导培养重组表达菌,对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析,发现重组蛋白以包涵体的形式表达,约为40 000,与理论值相符。将纯化后的重组蛋白免疫家兔,制备兔抗T3223-7蛋白多克隆抗体,间接ELISA测定多抗效价达1∶320 000,Western blot检测表明制备的多克隆抗体能与T3223-7抗原发生特异性反应,并能识别和结合旋毛虫成虫排泄分泌物(ES)。 展开更多
关键词 旋毛虫 原核表达 多克隆抗体 dnaseⅱ
原文传递
旋毛虫Ts-DNaseⅡ-7蛋白对Caco-2肠上皮细胞屏障的影响 被引量:1
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作者 李䶮风 王静 +5 位作者 刘晓雷 白雪 唐斌 丁静 白玉梅 刘明远 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第3期351-357,共7页
为了探索旋毛虫成虫期核酸酶家族Ts-DNaseⅡ-7蛋白对Caco-2肠上皮细胞屏障模型的作用及机制,本研究采用Transwell细胞培养板构建Caco-2肠上皮细胞屏障,当跨膜电阻值(TEER)达到400Ω·cm^(2)即判定肠上皮屏障模型构建成功。将试验组... 为了探索旋毛虫成虫期核酸酶家族Ts-DNaseⅡ-7蛋白对Caco-2肠上皮细胞屏障模型的作用及机制,本研究采用Transwell细胞培养板构建Caco-2肠上皮细胞屏障,当跨膜电阻值(TEER)达到400Ω·cm^(2)即判定肠上皮屏障模型构建成功。将试验组分为对照组(control)、PBS组、Ts-DNaseⅡ-7组(5μg/m L)、阳性对照LPS组(15μg/m L),作用48 h后,检测跨上皮电阻值(TEER)和对FITC的通透性;Western-blot和荧光定量PCR(qPCR)检测各组细胞Claudin 1、Occludin和ZO-1的蛋白表达水平和m RNA表达水平;通过细胞免疫荧光观察各组紧密连接蛋白的分布情况。结果,与对照组相比,Ts-DNaseⅡ-7组在第48小时TEER值降低,FITC的通透性增加;Claudin 1、Occludin和ZO-1的蛋白及m RNA的表达水平降低;免疫荧光试验可见细胞间的网状结构荧光不连续。结果表明,旋毛虫成虫期Ts-DNaseⅡ-7蛋白可破坏肠上皮细胞的物理屏障,有助于旋毛虫实现顺利寄生。 展开更多
关键词 旋毛虫 Ts-dnaseⅱ-7 肠屏障 通透性 紧密连接蛋白
原文传递
鼠脱氧核糖核酸酶(DNase Ⅱα)基因的克隆及原核表达
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作者 王卫芳 刘明远 +8 位作者 欧阳红生 吴秀萍 王学林 刘玛峰 杨勇 孙磊 王子见 张瑞 于艳玲 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期752-755,共4页
根据鼠脱氧核糖核酸酶Ⅱ(DNaseⅡ)基因设计引物,通过RT-PCR扩增出鼠DNaseⅡα基因片段,克隆到pMD-18T载体,然后转化至大肠杆菌JM109。经鉴定及序列测定,克隆基因与鼠DNaseⅡα基因序列完全一致,大小为1 008 bp。将重组质粒pMD-DNaseⅡ... 根据鼠脱氧核糖核酸酶Ⅱ(DNaseⅡ)基因设计引物,通过RT-PCR扩增出鼠DNaseⅡα基因片段,克隆到pMD-18T载体,然后转化至大肠杆菌JM109。经鉴定及序列测定,克隆基因与鼠DNaseⅡα基因序列完全一致,大小为1 008 bp。将重组质粒pMD-DNaseⅡα进行酶切后连接到原核表达载体pET-28a中,重组质粒经PCR和双酶切鉴定及序列分析正确后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE检测,然后进行初步纯化,Western-blot鉴定。结果表明,本试验成功构建了pET-28a-DNaseⅡα表达载体;表达产物以包涵体形式存在,相对分子质量约为38 800;初步纯化的目的蛋白在SDS-PAGE图谱上呈单一条带,Western-blot鉴定能与抗体发生特异免疫反应。 展开更多
关键词 脱氧核糖核酸酶(dnase ) 克隆 原核表达
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Effects of Nephrolithiasis on Serum DNase(Deoxyribonuclease Ⅰ and Ⅱ) Activity and E3 SUMO-Protein Ligase NSE2(NSMCE2) in Malaysian Individuals 被引量:1
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作者 Faridah Yusof Atheer Awad Mehde +3 位作者 Wesen Adel Mehdi Raha Ahmed Raus Hamid Ghazali Azlina Abd Rahman 《Biomedical and Environmental Sciences》 SCIE CAS CSCD 2015年第9期660-665,共6页
Objective Nephrolithiasis is one of the most common disorders of the urinary tract. The aim of this study was to examine a possible relationship between DNase Ⅰ/Ⅱ activity and E3 SUMO-protein ligase NSE2 in the sera... Objective Nephrolithiasis is one of the most common disorders of the urinary tract. The aim of this study was to examine a possible relationship between DNase Ⅰ/Ⅱ activity and E3 SUMO-protein ligase NSE2 in the sera of nephrolithiasis patients to evaluate the possibility of a new biomarker for evaluating kidney damage. Methods Sixty nephrolithiasis patients and 50 control patients were enrolled in a case-control study. Their blood urea, creatinine, protein levels and DNase Ⅰ/Ⅱ activity levels were measured by spectrometry. Serum NSMCE2 levels were measured by ELISA. Blood was collected from patients of the government health clinics in Kuantan-Pahang and fulfilled the inclusion criteria. Results The result indicated that mean levels of sera NSMCE2 have a significantly increase(P〈0.01) in patients compared to control group. Compared with control subjects, activities and specific activities of serum DNase Ⅰ and Ⅱ were significantly elevated in nephrolithiasis patients(P〈0.01). Conclusion This study suggests that an increase in serum concentrations of DNase Ⅰ/Ⅱ and E3 SUMO-protein ligase NSE2 level can be used as indicators for the diagnosis of kidney injury in patients with nephrolithiasis. 展开更多
关键词 Nephrolithiasis dnase dnase E3 SUMO-protein ligase NSE2 NSMCE2
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