A组乙型溶血性链球菌DN aseB基因亚克隆及pET-28a(+)-DNaseB载体构建

运用PCR扩增技术,以质粒pMD18-T-DNaseB为模板,扩增出0.5 kb截短的DNaseB基因,先将该基因片段与pMD19-T载体连接,确定该序列正确并进行大量繁殖后,再将DNaseB基因定向克隆入pET-28a(+)表达载体中,构建新的原核表达载体pET-28a(+)-DNaseB,转化该重组质粒至受体菌E.coli DH5a中,采用SDS碱裂解法提取该质粒DNA,经EcoR I和Hind双酶切鉴定和核苷酸序列分析,证实插入的基因片段具有正确的DNaseB基因核苷酸序列,将pET-28a(+)-DNaseB转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经过IPTG诱导其目的蛋白得到了表达.

应用实时荧光PCR法检测食品中的酿脓链球菌

目的:建立一种简单、快速、准确的检测酿脓链球菌的方法,为食品中酿脓链球菌的检测提供依据和便利。方法:实验采用Taq Man探针法,针对酿脓链球菌DNase B基因设计引物探针,用特异性实验、灵敏性实验、模拟样品实验对该方法进行验证。结果:该实时荧光PCR体系的特异性良好,酿脓链球菌的DNA扩增结果为阳性,链球菌属的其他细菌以及属外的常见菌DNA扩增均为阴性;灵敏性实验和模拟样品试验中最低检出限分别为50和23pg/μL,数量级一致,说明了该PCR体系在对含有肉类食品中酿脓链球菌的检测仍然保持有较高灵敏度。结论:目前国内单独的应用实时荧光PCR法对酿脓链球菌检测的文章比较少,本实验建立了检测酿脓链球菌的实时荧光PCR方法,特异性和灵敏性良好,实验过程省时省力,具有较高应用价值。