三角梅甜菜色素代谢酶4,5-DOPA-dioxygenase基因的分离和表达

甜菜色素在自然界中与花青素排斥分布,主要在石竹目(Caryophyllales)的9个科的植物中合成。虽然甜菜色素的生物合成已经有很多猜测,酶催化的生物合成关键步骤仍然缺少足够的实验数据支持。本研究首先从三角梅属的3个种(B.spectabilis‘Splendens’,B.buttiana‘Mahara’,B.pruviana‘Thimma’)的苞片中分离了甜菜色素合成途径末端的关键酶4,5-DOPA-dioxygenase完整的cDNA,大小分别为902、899、899 bp,分别编码298、297、297个氨基酸,并对这3个同源基因与已经报道的来自B.glabra的该基因进行比较。推测的分子量分别为33 758、33 076、33 233 u,等电点(pI)分别是5.62、5.54和5.94。对分属于4个种(B.spectabilis‘Splendens’,B.buttiana‘Mahara’,B.glabra‘Alba’,B.pruviana‘Thimma’)花的4,5-DOPAdioxygenase的Real-time分析结果表明,该基因在4个种的花中,种间变化较大,总体趋势是开花早期该基因的表达较弱,盛花期表达迅速增强,后期又呈现下降。其中,在红色的B.buttiana‘Mahara’中,该基因的表达最强,在白色的B.glabra‘Alba’中表达最弱。这些结果表明,该基因的表达与花的颜色鲜艳程度直接相关。

三角梅品种‘绿叶樱花’4,5-多巴双加氧酶开放阅读框克隆与分析

【目的】多巴双加氧酶(4,5-DOPA dioxygenase extradiol)是甜菜色素生物合成途径的关键酶之一,能催化多巴分解形成甜菜醛氨酸,也是最可能与三角梅最终的花色形成相关的酶蛋白。克隆三角梅多巴双加氧酶基因的开放阅读框(ORF),对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析,探讨三角梅花色变化机理和甜菜色素代谢途径。【方法】以三角梅品种‘绿叶樱花’的苞片为材料,提取其RNA,并进行逆转录,之后快速转化完成基因的克隆和基因PCR扩增,最后对其编码的氨基酸序列进行保守区预测、信号肽分析、磷酸化位点预测、跨膜信号预测、同源性比对、构建系统进化树以及二、三级结构预测,研究其氨基酸序列的结构和功能。【结果】‘绿叶樱花’的多巴双加氧酶基因ORF序列长801 bp,编码266个氨基酸。ORF序列所编码的氨基酸序列具有cd07363保守结构域,其编码蛋白是一种稳定的酸性亲水蛋白,分子量为29 734.76 kD,等电点为6.26,二级结构包含了11个α螺旋、7个β转角、20个β折叠结构,具有4个磷酸化位点,没有跨膜结构,可能只在细胞质内发挥作用。该序列还与66个序列高度同源,与同科的‘金心双色’、胶果木和梭房叶子花有着相同的进化分支,符合自然进化规律。【结论】‘绿叶樱花’多巴双加氧酶开放阅读框ORF的氨基酸序列属于第三类雌二醇双加氧基因家族,具有该基因家族具有的保守氨基酸序列,表明多巴双加氧酶基因在生成甜菜色素植物中具有独特的保守性,且属于稳定、酸性的亲水蛋白,没有跨膜结构,可能只在细胞质内发挥作用。三角梅中控制花色变化的主要是甜菜色素,研究三角梅甜菜色素合成途径中的关键酶,解析其甜菜色素的合成代谢机制,可为三角梅花色形成机制提供理论参考,有望在今后的工作中,利用转基因手段丰富三角梅花色。

藜麦4,5-多巴双氧化酶基因(CqDODA)家族的全基因组鉴定与分析

基于藜麦高质量基因组数据,鉴定了18个CqDODA基因家族成员,并对其进行了系统分析。结果表明:大多数CqDODA蛋白理化性质差异较小;根据CqDODA基因的亲缘关系可分为三支,分支1中的8个CqDODA基因在甜菜素合成中具有重要的作用;分支1的CqDODA基因结构差异较小,并且蛋白高度保守;CqDODA基因在逆境胁迫或者激素处理下可能存在响应。本研究结果可为深入研究CqDODA基因在藜麦甜菜素合成中的作用提供理论依据。

叶子花重瓣品种DOD基因序列比对分析

叶子花品种的苞片色彩丰富艳丽,是研究颜色表达调控的优良材料。对调控甜菜色素合成酶的DOD基因进行比对分析,以探讨叶子花的DOD基因与其苞片颜色表达的关联。通过对5个具有不同苞片颜色的重瓣叶子花栽培品种DOD基因转录组测序,应用软件ClustalX 2.0进行DOD cDNA序列比对分析,结果显示其序列同源性达100%,其调控色素合成的功能基因序列并没有差异。叶子花重瓣栽培品种的不同苞片颜色的表达与DOD基因对色素合成的调控可能无直接关联。

三角梅4,5-多巴双加氧酶基因的克隆与表达分析

本研究通过同源克隆技术对三角梅(Bougainvillea glabra Choisy)甜菜色素合成途径中4,5-多巴双加氧酶(4,5-DOPA dioxygenase,DOD)基因进行了克隆分析。随后将获得的三角梅DOD基因克隆到表达载体pET30b(+)上,构建原核表达载体pET30b(+)-DOD,并转入大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达。同时结合实时荧光定量PCR技术分析了遮光处理对三角梅DOD表达量和甜菜红素含量的影响。结果表明,三角梅DOD基因的cDNA序列长度为804 bp,编码268个氨基酸,GenBank登录号为KY676801。系统进化树分析显示该DOD与叶子花(Bougainvillea spectabilis Willd.)和紫茉莉(Mirabilis jalapa L.)DOD亲缘关系比较近;原核表达得到约37 k D的目的蛋白,这与预测结果相符合;实时荧光定量PCR结果表明,遮光处理使DOD表达量降低;同时,甜菜红素含量也表现为下降。这些研究结果为解析三角梅甜菜色素合成途径提供了理论依据,为三角梅花色形成机制的研究提供了基础资料。

叶子花花色DOD基因全长cDNA克隆与序列分析

以叶子花花苞为材料,运用RACE技术克隆出了叶子花苞片中的多巴双加氧酶基因cDNA全长,探讨叶子花花色变化机理和甜菜色素代谢途径。该序列长度为1 059 bp,开放阅读框位于56-802 bp之间,共编码249个氨基酸残基。对该氨基酸序列进行生物信息学分析,结果表明该氨基酸序列具有多巴双加氧酶保守结构域,所组成的蛋白分子量为27.94 kD,等电点为5.48,是稳定蛋白。对其二级结构进行预测:该序列具有8个α螺旋、8个β转角、20个β折叠,其序列大多是由亲水性氨基酸残基组成,不具有跨膜结构和信号肽。对该氨基酸序列进一步的Blast比对,发现组成多巴双加氧酶的氨基酸序列因植物种类而异,且亲缘关系越远,差异越大,结合花青素与甜菜色素代谢途径的不同和在自然界中不能共存的现象,表明多巴双加氧酶基因在生成甜菜色素植物中具有独特的保守性。