玉米细菌性枯萎病菌改良Dot-ELISA检测研究

通过激光切割技术加工出硝酸纤维素膜小圆片并粘贴在已打孔的塑料胶条上,制成包含8个圆片的NCM条(NCM test strip),进一步在NCM条上建立了玉米细菌性枯萎病菌的Dot-ELISA检测方法。研究发现,在NCM圆片上的Dot-ELISA检测灵敏度与点样量密切相关,采用10μL/点的加样量比通常的1μL/点可提高检测灵敏度10-100倍;间接Dot-ELISA的检测灵敏度是双抗夹心dot-ELISA的10倍,该结果进一步在微孔板ELISA的检测中得到证实。玉米细菌性枯萎病菌的改良Dot-ELISA检测是一种较为灵敏、快速、稳定、规范的实验方法,为进一步研究该病菌的微流控芯片斑点免疫检测方法奠定了前期工作基础。

禽流感(H9N2亚型)酶标抗体的制备及双抗夹心Dot-ELISA检测方法的建立

采用AIV灭活油乳苗(H9N2)对AIV非免疫鸡进行接种并获取高免血清,取高免血清采用饱和硫酸铵沉淀法,经过Sephadex G25层析柱提纯后可获得纯度很好的IgG。将IgG应用过碘酸钠法标记辣根过氧化酶(HRP),制备禽流感酶标抗体(IgG-HRP),利用所提取的AI-IgG和所制备的禽流感酶标抗体按照双抗夹心Dot-ELISA试验操作步骤,采用方阵法分别摸索包被抗原及酶标抗体的最佳浓度,以及各步反应时间等最佳反应条件,以建立一种优化的AIV双抗夹心Dot-ELISA检测法。结果表明,所制备的AI高免血清HI效价为10log2;AI酶标抗体克分子比值为2.45;优化的Dot-ELISA各条件为:包被AI-IgG最佳稀释倍数为1∶50;最佳封闭剂为1%牛血清白蛋白;AI酶标抗体最佳稀释倍数为1∶100;待检抗原与2种抗体的感作时间均为0.5h(37℃)。优化后的检测方法可在2.5h内诊断结果,制备好的包被膜在4℃下保存2个月不影响其效果。而且敏感性提高了3倍,与新城疫病毒液、传染性支气管炎及减蛋综合症病毒液无交叉反应。

单克隆抗体Dot-ELISA检测血吸虫病循环抗原的研究.Ⅰ.

将血吸虫肠相关阴极抗原的单克隆抗体3D8A联结过氧化物酶后用于直接法Dot-ELISA检测急性、慢性与晚期血吸虫病人血清中循环抗原,阳性率分别为90.6、83.2及30.7％。正常人血清及非寄生虫感染病人血清均未见阳性反应。EPG>100组血清阳性率及抗原水平高于EPG<100。慢性血吸虫病人经吡喹酮治疗后一年,粪检阴性者大部分血清抗原转为阴性;粪检阳性者血清检查仍为阳性。结果表明,肠相关阴极抗原单克隆抗体3D8A能用于Dot-ELISA检测各期病人血清中循环抗原,并能反映病人感染度与药物治疗效果。

Dot-ELISA检测猪胴体中沙门氏菌的研究

应用Dot-ELISA法对西宁某猪屠宰点 85份猪胴体进行了沙门氏菌的检测 ,同时采用常规分离培养鉴定技术作对照实验。结果在 85份肉样中 ,Dot-ELISA检出沙门氏菌阳性 6 5份 ,阳性率为 76 .4 7% (6 5 /85 ) ;而常规分离培养鉴定技术检出沙门氏菌阳性 6 7份 ,阳性率为 78.82 % (6 7/85 ) ,此两种方法的阳性符合率为 86 .5 7%。经统计分析 ,两种方法差异不显著 (P >0 .0 5 )。

应用DotPPAELISA检测猪布氏杆菌病抗体的研究

本试验以布氏杆菌ＳＡＴ 为对照试验，建立了ＤｏｔＰＰＡＥＬＩＳＡ 检测猪布氏杆菌病抗体的方法，该法检测的猪ＩｇＧ 含量可达６９９２×１０－ ９ｇ，灵敏性高，不同猪抗ＰＲＶ、ＰＰＶ、ＨＣＶ、ＪＥＶ、ＣＨＬ 等阳性血清发生交叉反应，特异性强；此外该法还具有操作简便、快捷不需特殊试验条件、结果客观、肉眼易于判断、反应膜片可长期保存等优点。适宜在广大基层单位应用，对布病的快速诊检有着十分重要的意义。

Dot-ELISA检测鸭瘟病毒的研究

用斑点酶联免疫吸附试验检测15头份鸭瘟强毒人工发病雏鸭的粪便,检出率达87％,三次重复检测,符合率达100％。该法简便、快速、准确、经济,易于在基层推广应用。

蚯蚓抗原抑制性Dot-ELISA检测蠕虫病患者血清抗体的实验研究

目的 建立蚯蚓抗原抑制性Dot-ELISA ,并观察其对日本血吸虫病、肺吸虫病、旋毛虫病人血清抗体检测特异性的影响。方法 应用Pa -Ag抑制性Dot-ELISA对 15 8份日本血吸虫病人、97份肺吸虫病人和 6 2份旋毛虫病人阳性血清进行检测 ,并将结果与Dot-ELISA所获结果予以比较分析 ,观察两种方法之间有无显著性差异。结果 Pa -Ag抑制性Dot -ELISA在SEA、Pw -Ag和Ts-Ag的交叉反应抑制率 (39 90 %～ 94 72 % )与Dot -ELISA比较有显著性差异 (P >0 0 5～0 0 1)。结论 Pa -Ag抑制性Dot-ELISA在显著提高寄生蠕虫病血清免疫学诊断特异性的同时 ,又保证了其 10 0

Dot-ELISA检测副鸡嗜血杆菌血清型特异性抗原的研究

本研究在副鸡嗜血杆菌型特异性单克隆抗体的基础上建立了检测该菌 Ａ、 Ｃ 型特异性抗原的 Ｄｏｔ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 方法，结果表明本方法在检测副鸡嗜血杆菌型特异性抗原时未呈现与其它 ８ 种常见病原体的交叉反应，新鲜肉汤的最低检出量为 Ａ 型 １３×１０６ Ｃ Ｆ Ｕ／ｍ ｌ和 Ｃ 型 ８×１０６ Ｃ Ｆ Ｕ／ｍ ｌ，抗原的最低检出量均为 ２５μｇ／ｍ ｌ，对 ２０ 份抗原、肉汤和卵黄样品的检测结果与其已知结果相符。这就证明本方法具有较好的敏感性和特异性，是一种能直接检测分离株血清型的良好方法。

Dot-ELISA检测人芽囊原虫血清抗体的研究

分别收集本院大学生322份血清和粪便,将粪便用体外培养法作为金标准检测出人芽囊原虫阳性178例,阴性144例。用dot-ELISA分别对体外培养法阳性者和阴性者血清进行检测,敏感度为92.13%(164/178),特异度为97.92%(141/144)。表明dot-ELISA用于检测人芽囊原虫血清抗体较敏感、特异。

应用Dot-ELISA检测马铃薯卷叶病毒

以硝酸纤维素膜(NCM)为固相载体,应用间接ELISA法对纯化的马铃薯卷叶病毒(PLRV)、感染PLRV的马铃薯植株的茎、叶、休眠块茎顶端、脐部、块茎打破休眠后萌发的芽,以及饲毒后的桃蚜体内的PLRV分别进行了测定。结果表明检测纯病毒的灵敏度为45.83pg～4.583pg,测定茎、叶、休眠块茎顶端、脐部、芽的稀释度分别可达到1/2048、1/512、1/2048～1/8192、1/512～1/2048和1/2048～1/8192,和常规DAS-ELISA相比,检测的灵敏度提高至少8倍。应用Dot-ELISA至少可检测1/2头带毒蚜虫体内的PLRV。

应用Dot－ELISA技术检测草鱼出血病病毒的研究

报道了斑点免疫吸附ＥＬＩＳＡ（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）快速检测草鱼出血病病毒（ＧＣＨＶ）的方法以及对提纯病毒、染毒细胞内病毒和病鱼组织的检测结果，并对该方法的灵敏度与ＳＰＡ－ＣｏＡ和常规ＥＬＩＳＡ法进行了系统的比较。结果表明，Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检出ＧＣＨＶ的最低含量为３ｐｇ，该灵敏度比ＳＰＡ－ＣｏＡ和常规ＥＬＩＳＡ法分别提高１０倍和２０倍，而且快速易行，是目前检测ＧＣＨＶ最为有效的方法，并可在草鱼出血病临床诊断和病毒疫苗质量鉴定等方面得到应用。

庆大霉素快速Dot-ELISA检测方法的建立及初步应用

本研究旨在建立一种适用于快速、现场检测要求的庆大霉素残留Dot-ELISA检测方法。将硝酸纤维素膜用激光切割成小圆片,粘贴到激光打孔的塑料胶条上,制成8个圆片组成的NC膜检测条。通过条件优化,建立了基于NC膜条的庆大霉素残留直接竞争Dot-ELISA检测方法。结果表明,该方法可以快速检测牛奶等食品中的庆大霉素残留,检测灵敏度达到60 ng/mL,可用于庆大霉素残留的筛查。与微孔板ELISA相比,Dot-ELISA可以大大节省检测时间。直接竞争Dot-ELISA具有简便、快速、灵敏、直观的特点,具有推广和应用价值。

Dot-ELISA法检测致病性嗜水气单胞菌

在鱼类致病性气单胞菌诊断试剂盒的基础上,用斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)检测致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)胞外蛋白酶ECPase54,同时用脱脂奶平板、PCR特异性扩增气溶素基因aer和16SrRNA基因检测72株气单胞菌分离株。结果显示致病性嗜水气单胞菌检测阳性率分别如下:Dot-ELISA法90.3%(65/72)、脱脂奶平板法75%(54/72)、aer基因PCR法94.4%(68/72)、16SrRNA PCR法81.9%(59/72),Dot-ELISA与其他3种方法的符合率分别为79.2%(57/72)、91.6%(66/72)、81.9%(59/72)。在ECPase54兔抗血清制备后的2、4、6、12、18个月,用Dot-ELISA检测72株分离株,检测结果重复性好。结果表明Dot-ELISA法敏感、特异、实用,可用于鱼类致病性Ah的临床诊断。

番茄斑萎病毒外壳蛋白原核表达及Dot-blotELISA检测方法的建立

将番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)全长外壳蛋白基因亚克隆到原核表达载体pET-32a中,经限制性酶切分析及测序结果表明插入方向正确且阅读框架无移码突变.将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),SDS-PAGE分析结果证实IPTG可诱导1个分子量约为48 kDa的融合蛋白表达.利用6×His标签单抗和TSWV FoPaTs1多抗证实所表达的蛋白为TSWV外壳蛋白.以纯化的重组外壳蛋白免疫小鼠,制备杂交瘤细胞培养上清单抗,并用杂交瘤细胞培养液上清建立了可靠、有效检测TSWV的Dot-blot ELISA方法.

抗卵巢抗体ELISA间接检测法的建立与临床应用

抗卵巢抗体ＥＬＩＳＡ间接检测法的建立与临床应用张毅林，黄邱朝，武建国（南京军区南京总医院临床免疫科，南京２１０００２）抗卵巢抗体（ａｎｔｉｏｖａｒｉａｎａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＯＡｂ）是一种针对卵巢颗粒细胞、卵母细胞和激素生成细胞的自身抗体。目前检测...

养殖刺参腐皮综合征两种致病菌Dot-ELISA快速检测

以养殖刺参(Apostichopus japonicus)腐皮综合征两种主要致病原灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)为抗原,分别制备兔抗血清,建立了两种病原菌的点酶ELISA(Dot-ELISA)检测方法。根据方正试验,确定检测用一抗、二抗最佳工作稀释度:灿烂弧菌抗血清稀释度320,酶标二抗稀释度3 000;假交替单胞菌抗血清稀释度160,酶标二抗稀释度2 000。阻断试验结果表明两种抗血清特异性均较高。灿烂弧菌抗血清在稀释度为40时与溶藻胶弧菌、河流弧菌、创伤弧菌等弧菌发生微弱交叉反应,提高稀释度到160时,不发生交叉反应。假交替单胞菌抗血清基本不与常见海水致病弧菌发生交叉反应。人工感染试验检测结果表明该方法能从患病海参溃烂组织、未发病海参组织和感染水体检测到相应致病菌,检测灵敏度为9.4×103个/mL。人工感染试验检测结果经直接凝集反应验证。该方法操作简便、灵敏度高,不需复杂仪器设备,适合在基层推广。

单克隆抗体Dot-ELISA检测血吸虫病人循环抗原

制备抗日本血吸虫排泄分泌抗原单克隆抗体(McAb),应用于斑点酶联免疫吸咐试验(Dot-ELISA)检测血吸虫病人循环抗原.血吸虫病人血清的阳性率为80.9％(152/188),其中EPG为1～24、25～99和≥100的病人检出率分别为76.8％、86、6％和100％。血吸虫病人经吡喹酮治疗1年以上粪检阴性者50例,均为阴性.并殖吸虫病人、华支睾吸虫病人、丝虫病人和健康人血清均为阴性.McAb-Dot-ELISA操作简便,试剂用量少,肉眼判断结果,可用于血吸虫病的诊断和疗效考核。

间接法Dot－ELISA检测鸡败血支原体（MG）抗原的研究

本文首次建立了检测鸡败血支原体（ＭＧ）抗原的间接法Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ。ＭＧ抗原的最低检出量为７．８１×１０￣４ＣＦＵ／ｍｌＭＧ人工及自然感染样本的抗原检测结果与ＭＧ分离的符合率分别为８４．６％和９２．９％。间接法Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检测抗原经济、快速、操作简便，有较好的敏感性、特异性和重复性，能检出ＭＧ人工及自然感染病鸡的带菌情况，适合于大规模抗原样本的检测，可以用作疫病早期诊断的依据和进行流行病学调查。

Dot-PAA-ELISA快速检测猪丹毒抗体方法的建立与应用

以猪丹毒CD30 0 4 (1a型 )和C4 3_12 (2型 )菌株为抗原提取菌株 ,EDTA渗透法提取的抗原作为膜载抗原 ,建立了Dot_PAA_ELISA检测猪丹毒血清抗体方法 ,经研究确定了Dot_PAA_ELISA的最佳工作条件。试验制备的诊断膜片特异性强 ,不与猪瘟、猪伪狂犬病、猪肺疫、猪链球菌病、猪大肠杆菌病、仔猪副伤寒、猪布氏杆菌病、猪衣原体病的阳性血清发生交叉反应 ;灵敏度高 ,能够最低检出猪血清中含 2 6 1× 10 -9g的猪IgG抗体 ;膜片保存期长 ,在室温可保存 4个月 ,4℃可保存 7个月其检测活性不变。用该方法检测了仔猪免疫后抗体变化 ,并通过猪丹毒三型混合强毒攻毒试验确定了猪能抗强毒攻击的抗体临界保护值为 1∶32。对 336份血清进行猪丹毒抗体检测 ,阳性检出率为 96 13%。试验结果表明 ,本试验方法操作简便、快速准确、结果可存档、重复性和稳定性好 ,所用试剂材料均可做到标准化 。