荷斯坦奶牛DPP6和PRKN基因的生物信息学及表达规律分析

【目的】旨在探究前期GWAS筛选出的与荷斯坦奶牛产奶相关的二肽基肽酶样6(Dipeptidyl Peptidase⁃like 6,DPP6)和E3泛素连接酶基因(Parkin gene,PRKN)的生物学性质及表达特性,为后续验证DPP6和PRKN基因对于荷斯坦奶牛相关调控机制研究提供基础。【方法】利用ProtParam、Phyre2、NetPhos 3.1等软件分析DPP6和PRKN的理化性质与蛋白结构,并采用实时荧光定量PCR(Real⁃Time quantitative PCR,RT⁃qPCR)检测DPP6和PRKN基因在荷斯坦奶牛的心脏、脾脏、肝脏、肺脏、肾脏、乳腺、子宫、卵巢、瘤胃、黄体10个组织中的表达规律;通过脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导乳腺上皮细胞(bMECs),初步检测DPP6和PRKN基因在炎症反应中的表达模式。【结果】DPP6蛋白编码863个氨基酸,与山羊的亲缘关系最近;PRKN蛋白编码488个氨基酸,其中甘氨酸含量最多,其序列与马鹿的相似性最高,保守型较强。本研究推测2个物种的DPP6和PRKN蛋白可能具有相似的生物学功能,并且2个蛋白均属于不稳定亲水性蛋白。DPP6和PRKN基因在组织中普遍表达。其中,DPP6基因在乳腺、肺脏、脾脏以及肾脏组织中的表达量显著高于其他组织,而PRKN基因在乳腺、肾脏、瘤胃组织中显著高表达。此外,相比于空白对照组,DPP6与PRKN基因均能够在LPS诱导的bMECs中极显著表达(DPP6基因极显著下调,PRKN基因极显著上调)。【结论】DPP6与PRKN基因可能在调控荷斯坦奶牛乳房炎症过程中发挥潜在作用,为后期荷斯坦奶牛DPP6与PRKN两个基因在奶牛bMECs炎症反应相关调控机制研究提供理论依据。

腺病毒介导的DPP6过表达载体的构建及其在大鼠心肌细胞内表达的鉴定

目的:构建腺病毒介导的DPP6过表达载体并验证其在大鼠心肌细胞内的表达.方法:应用PCR技术扩增目的基因DPP6,经酶切、连接等反应将目的基因插入穿梭载体p Shuttle-CMV中,进而转化至含有Ad Easy质粒的大肠杆菌中,进行重组;所产生的腺病毒载体转染在HEK-293细胞中,进行腺病毒的包装、分泌和扩增,所得病毒感染大鼠心肌细胞,进行荧光及实时定量PCR(q PCR)鉴定.结果:DPP6过表达腺病毒载体构建成功,经HEK293细胞包装、扩增后,所得病毒可成功感染初生大鼠心肌细胞,观测到腺病毒携带的绿色荧光蛋白表达,q PCR检测DPP6 mRNA表达明显升高.结论:成功构建了腺病毒介导的DPP6过表达载体,并在大鼠心肌细胞内成功表达,为进一步研究DPP6在心肌细胞内的功能奠定了基础.

SMAD6在Aβ诱导的神经毒性病变中的表达变化

目的探讨母抗Dpp小同源物6(small mothers against decapentaplegic homolog 6,SMAD6)在β淀粉样蛋白(amyloidβ,Aβ)诱导的神经毒性病变中的表达变化。方法取孕15~17d的SD大鼠的胎鼠,进行海马神经元原代培养,经不同浓度(10、15、20μmol/L)Aβ25-35毒性片段处理后,通过定量PCR技术检测SMAD6mRNA表达水平。取2月龄SD雄性大鼠12只,随机分为Aβ注射组和空白对照组,每组6只。采用双侧基底前脑注射Aβ1-40建立大鼠痴呆模型,通过免疫组化及免疫印迹检测基底前脑及海马区SMAD6蛋白表达水平。结果不同浓度Aβ25-35处理组海马神经元内SMAD6mRNA表达均较对照组减少(F=602.1,P<0.01)。免疫组化结果显示,与对照组比较,Aβ1-40注射组大鼠基底前脑区SMAD6蛋白表达减少(68103±1520比96036±1804;t=20.51,P<0.01),而海马区其表达增多(96441±1852比55039±1528;t=29.87,P<0.01);免疫印迹结果显示,与对照组比较,Aβ1-40注射组大鼠基底前脑区SMAD6蛋白表达减少(0.1042±0.0067比1.000±0.0986;t=15.69,P<0.01),而海马区其表达增多(12.5525±2.6803比1.000±0.0135;t=7.465,P<0.01)。结论 Aβ可直接下调神经元内SMAD6mRNA转录及表达,不同脑区内SMAD6蛋白表达可能受负反馈调节机制影响。