绵羊和人主要组织相容性复合体DRB1基因外显子2多态性及生物信息学分析

本试验旨在研究绵羊和人的主要组织相容性复合体(MHC)DRB1基因外显子2(exon2)单核苷酸多态性(SNPs)和单氨基酸多态性(SAPs),并进行生物信息学分析。运用生物基因组学数据库,利用生物信息学及比较基因组学方法对人与绵羊MHC-DRB1基因exon2序列多态性进行分析,采用生物信息学软件对绵羊MHC-DRB1的蛋白质结构及生物学功能进行预测和分析。结果显示,人主要组织相容性复合体(HLA)和绵羊主要组织相容性复合体(OLA)的DRB1exon2均存在丰富的SNPs位点和SAPs位点,单一多态位点和简约多态位点数不尽相同,二者相比仅有14个SNPs位点相同,其余位点均不同。序列分析结果表明,二者MHC-DRB1exon2序列具有高度相似性。进一步生物信息学分析结果显示序列变异引起的单氨基酸变化引发了蛋白质二级结构和三级结构的改变,可能因此会引起基因功能的异常,从而引发抗病性和疾病易感性的变异。

用PCR-SSP方法检测中国恒河猴Mamu-DRB*W101和Mamu-DRB*W201基因

利用序列特异引物聚合酶链反应(polymerase chain reactionsequence-specific primers,PCR-SSP)方法扩增中国恒河猴的主要组织相容性复合体II类基因Mamu-DRB*W101、-DRB*W201,初步了解中国恒河猴中Mamu-DRB*W101、-DRB*W201基因的阳性率。采集中国恒河猴静脉血,用DNA提取试剂盒提取全血DNA,分别用Mamu-DRB*W101、-DRB*W201特异引物PCR扩增Mamu-DRB*W101、-DRB*W201基因的第二外显子区域,并对扩增出的阳性条带进行测序,与已知序列对比验证序列是否正确。共检测了来自136只中国恒河猴的样本,PCR检测出Mamu-DRB*W101阳性个体10只,Mamu-DRB*W201阳性个体也是10只,其阳性个体所占比率均为7.35%。测序结果表明,PCR扩增产物的核苷酸序列与基因库中的序列完全一致。本研究表明中国恒河猴中存在Mamu-DRB*W101、-DRB*W201基因阳性个体,为中国恒河猴在AIDS研究中的应用及进一步分析中国恒河猴MHC II类基因提供了基础。

中国荷斯坦牛BOLA-DRB上游近端调控区序列分析

通过PCR扩增及DNA序列测定,得到了中国荷斯坦牛BOLA-DRB基因的5'上游近端调控区(URR)序列。比较发现,与人、马以及羊的MHC-DRB基因的5'URR类似,牛MHC-DRB基因5'URR区同样存在与基因表达调控有关的高度保守的W、X、Y、CCAAT及类TATA调控元件,调控元件的组织结构也相同。

猪MHC-DQB、DRB近端调控区序列及其多态性

根据人MHC-DRB和MHC-DQB基因组序列和猪MHC-DRB和MHC-DQB基因外显子1设计引物,应 用PCR扩增及克隆测序技术,首次得到了猪MHC-DRB和MHC-DQB基因的5'上游近端调控区(URR)序列。分 析发现所得序列中存在与MHCⅡ类基因表达调控有关的高度保守的W、X、Y、CCAAT及类TATA调控元件,调控 元件的空间组织顺序也与其他物种相应序列的相同。利用SSCP技术在313头猪中共发现12个DRB-URR复等 位基因和14个DQB-URR复等位基因,序列比对结果表明在这些复等位基因中存在丰富的多态位点,为进一步深 入研究猪MHCⅡ类基因近端调控区的多态性及抗病育种研究奠定了基础。

HLA-DRB1等位基因的多态性及其应用

HLA系统参与和调节机体免疫功能,是人类重要的遗传标志,具有种族、地域差异。HLA-II类系统中DRB1等位基因的多态性最丰富,它的准确分型直接影响器官移植的供体选择、法医学个体认定、HLA与疾病相关性及人类学等研究。本文综述了HLA-DRB1分型检测方法,不同种族人群HLA-DRB1等位基因的多态性,HLA-DRB1多态性研究在探讨人类起源、民族融合方面的价值,HLA-DRB1与肝炎、系统性红斑狼疮等疾病的相关性等。

五指山猪近交系群体中DRA和DRB基因的SSCP检测

为确定五指山猪(WZSP)近交系群体SLA!ⅡDRA、DRB基因的等位基因数及其特性,利用PCR扩增SLA!ⅡDRA、DRB基因的第2外显子序列,经单链构象多态性即SSCP检测其等位基因数,选择纯合子个体的PCR产物直接测序。对所获得的序列与Genbank中所有相应的序列进行比对和聚类分析,特别是SLA!DRB!C、SLA!DRB!D、HLA!DRB*09012、HLA!DRB*1201、HLA!DRA*0101等位基因。结果表明:在WZSP近交系群体中,DRA、DRB各有2个等位基因且发现1个DRB新等位基因。DRA第2外显子有很强的保守性,而DRB基因呈现出高度的多态性,在核苷酸水平同源性为85%以上,氨基酸水平同源性为70%以上。该试验成功地检测了WZSP近交系SLA!DRA、DRB基因的等位基因及其特性,为建立WZSPSLA!DR基因抗原的分子分型及特异单倍型猪的培育研究奠定基础。

中国西北地区汉、回、维、藏民族HLA-DRB基因多态性的研究

按照第11届国际组织相容性抗原研讨会（11IHW）I作会议HLAⅡ类PCR-SSO分型标准和美国国立骨髓供者计划组织（NMD）对HLADRB位点等位基因分型要求，设计合成1对引物，扩增HLADRBDNA片段，长度为256bp，设计合成不同片段大小探针27种，可检出DRB座位上DRB1的39种等位基因，DRB3的3种等位基因，DRB4的1种等位基因和DRB5的3种等位基因。对西安地区汉（183份）、宁夏回（169份）、新疆维（2O0份）及西藏藏（188份）民族DRB的46种等位基因进行多态性分析，建立了4个民族正常群体DRB基因的遗传学参数，分析了他们在等位基因分布上的差异，结果表明：回族与北方汉族HLA遗传分布上没有较大差异，DRB1·02（16.9％）、·07（13．1％）和·09（12．0％）为高频基因：藏族检出等位基因数较前两者多，但没有显著的高频基因；维族等位基因分布整体接近高加索人种，但DRB1·07（23．8％）基因频率异常显著，暗示民族有遗传选择。

寡核苷酸DNA Microarray用于HLA DRB1基因分型的研究

对寡核苷酸DNAMicroarray用于HLADRB1基因分型的技术进行研究。常规的酚 /氯仿法提取标准血样基因组DNA ,在DRB1的exon 2区域设计一对引物 ,经PCR扩增基因组相应区段并用Cy5 dCTP进行标记。设计寡核苷酸分型探针 ,将探针固定在APS PDC法制作的DNAMicroarray上 ,用标记的PCR产物与之杂交 ,扫描仪对杂交结果进行扫描 ,Imagene软件对杂交图象进行分析。共检测了 33例标准血样的HLADRB1基因型。检测结果证明研制的DNAMicroarray准确、灵敏。DNAMicroarray技术可以有效地检测DRB1等位基因 ,对比常规的PCR SSP和PCR SSO方法、分型基因芯片方法更为直观 。

从杂草DRB中筛选微生物除草剂的研究

采用MPC和CVP富集培养基从马唐和狗尾草的根部分离到假单胞菌792株、欧文氏菌515株。通过对大肠杆菌的抗代谢毒性试验、对原宿主的萌发抑制试验、杀草试验以及对两种草坪草的安全性试验,筛选的S7菌株能100％抑制狗尾草的种子萌发,对供试草坪草不仅没有负影响,而且对高羊茅的种子萌发还有轻微的促生作用。尽管S7在狗尾草的芽后处理中校正防效只有56.7％,但分析认为以杂草DRB作微生物除草剂的目标菌株会更有前途。

广东地区CML患者中HLA-A,B,DRB1的表达与分析

为了调查慢性髓系白血病(CML)患者中HLA-A、B、DRB1基因多态性的表达,探讨HLA与CML之间的可能关联,采用DNA扩增基础上的反向序列特异性寡核苷酸杂交(PCR-RSSO)技术,对广东地区293例CML患者和随机同期采集的406名汉族健康献血者的HLA-A、B、DRB1位点进行基因多态性分型,并对2组间基因频率进行了比对分析。结果显示:CML组HLA-A*24基因频率为15.53%,显著低于对照组22.09%(RR=0.63,p=0.005),HLA-B*13基因频率为10.41%,与对照组6.74%相比则显著增高(RR=1.68,p=0.016),HLA-DRB1*14基因频率为7.51%,与对照组11.89%相比显著降低(RR=0.58,p=0.008)。结论:HLA-A*24、HLA-DRB1*14在广东地区CML患者中表达较正常人明显减低,HLA-B*13在广东地区CML患者中表达较正常人明显升高。HLA-A*24、HLA-DRB1*14是否为广东地区CML患者的保护性基因标记及HLA-B*13是否为其易感性基因标记尚需进一步研究明确。

4082名上海骨髓库汉族无关供者HLA-A、B、DRB1高分辨等位基因及单体型多态性研究

目的了解上海地区汉族人群HLA-A、B、DRB1在高分辨分型水平上的等位基因及单体型频率分布特征。方法采用PCR-测序分型技术(Sequence-based typing,SBT)对4 082名随机、无血缘关系、健康的中华骨髓库上海分库汉族造血干细胞捐献者进行HLA-A、B、DRB1高分辨基因分型,利用计数法和最大似然性原理方法分别计算HLA-A、B、DRB1等位基因及单体型频率。结果 4 082例样本中,共观察到204个HLA等位基因,其中频率>0.1的HLA-A、B、DRB1等位基因分别有A*11∶01、A*24∶02、A*02∶01、B*46∶01、DRB1*09∶01、DRB1*15∶01。841条A-B单体型中,70条单体型呈现显著的连锁不平衡(ALD>0,HF≥3.67×10-4,χ2>3.84),8条表现为强连锁不平衡(RLD>0.40),17条单体型的频率高于0.01;1 027条B-DRB1单体型中,99条单体型呈现显著的连锁不平衡(ALD>0,HF≥3.67×10-4,χ2>3.84),12条表现为强连锁不平衡(RLD>0.40),12条单体型的频率高于0.01;3 344条A-B-DRB1单体型中,681条单体型是"可靠的"(频率≥3.67×10-4),单体型频率高于0.001有135条。结论获得上海地区汉族人群HLA-A、B、DRB1高分辨等位基因频率和单体型分布数据及相关遗传参数,为临床移植供者的选择、中国人群CWD表的制订、骨髓库最适库容的评估及人类遗传学研究提供参考数据。

多浪羊MHC-DRB1基因多态性与包虫病抗性分析

通过PCR扩增122只包虫病(细粒棘球蚴病)阴性和70只包虫病阳性多浪羊的MHC-DRB1第2外显子,产物经SacⅠ、Hin1Ⅰ和HaeⅢ3种限制性内切酶酶切后进行RFLP多态性分析。结果表明,多浪羊MHC-DRB1基因第2外显子在SacⅠ、Hin1Ⅰ和HaeⅢ酶切位点存在丰富的多态性,分别检测出了2、2和6种等位基因,出现了3、3和18种基因型。将包虫病阴性和阳性多浪羊的等位基因频率和基因型频率分别进行比较分析,发现等位基因HaeⅢa对包虫病感染具有一定的易感性(P<0.05),SacⅠab和Hin1Ⅰaa 2个基因型对包虫病具有一定的抗性(P<0.05),HaeⅢbe和HaeⅢef这2个基因型对包虫病具有较强的易感性(P<0.01)。

中国大陆野猪SLA DRB基因exon2的序列变异分析

本文基于135头野猪样本中检测到的15种SLA DRB基因exon 2序列的遗传变异分析,探讨DRB基因在不同地理区域中自然选择的变化特征。研究发现DRB基因exon 2抗原结合位点的非同义替换率为同义替换率的2.95倍,表明该位点受到平衡选择的强烈作用。在系统发生分析中,在基于核苷酸序列构建的NJ树中,野猪DRB位点的15种等位基因全部聚为一枝,没有发现跨种多态现象;而在基于氨基酸序列构建的系统发生树中,野猪SLA-DRB*nnu6和人DRB基因exon 2片段聚在一起,这种氨基酸残基的高度相似可能是由于自然选择压力下产生的趋同。野猪DRB基因exon 2的序列多态性分析表明,东北野猪基因多态性低于四川野猪和华南野猪,这可能与不同气候条件和地理环境下的寄生虫等因素对SLA等位基因变异的影响存在差异有关。

牛BoLA-DRB_3基因的多态性与乳房炎相关性初探

利用PCR-RFLP技术对易感乳房炎的奶牛血样24份,不易感染乳房炎的2个黄牛品种南阳牛、秦川牛血样66份共计90个个体进行牛BoL A-DRB3基因第2外显子多态性分析。结果表明:扩增大小为252 bp的片段经限制性内切酶B stU I酶切后表现多态,且奶牛AA型个体显著高于黄牛品种,提示BoL A等位基因A作为母牛乳房炎易感性的候选标记具有潜在的有效性。

乙型肝炎病毒感染者HLADRB基因分型及其相关性研究

目的探索乙肝病毒(HBV)感染者HLA DRB基因频率及其与疾病的相关性。方法用PCR SSP对重庆地区汉族乙肝患者40例和正常人120名进行HLA DRB基因分型 ,结合临床病型与HBV复制状态作相关性分析。结果重庆地区汉族正常人以DR2(15)、DR5(12)、DR9 位点常见 ,乙肝患者与之比较DR3 基因频率明显增高(P<0.05) ,DR5(12)、DR7 基因频率也有增高 ,均见于慢性乙肝和肝硬化 ,相对危险度DR3 为2.4,DR7 为2.0。DR7基因多见于HBV高复制状态 ,相对危险度为2.4。结论HLA DR3 基因与重庆地区汉族慢性乙肝和肝硬化相关 ,DR7 与HBV高复制状态有关 ;免疫遗传因素参与慢性乙肝的发病机制。

绵羊DRB1基因生物信息学分析

利用生物基因组学数据库,对绵羊MHCⅡ区DRB1基因进行生物信息学分析,以预测DRB1基因编码产物的理化性质、结构与功能,同时构建DRB1同源基因的系统进化树。结果表明,DRB1基因编码产物为不稳定亲水性蛋白,具有明显的信号肽,其切割位点位于29-30位的氨基酸之间。二级结构主要以无规则卷曲和延伸链为主,主要在细胞质中发挥生物学作用。序列分析表明,DRB1编码产物可能具有免疫应答和受体、胁迫应答和信号转导等功能,可能在免疫应答和胁迫应答过程中发挥重要作用,可能对绵羊免疫力和抗病性起关键作用。DRB1基因编码产物氨基酸邻接系统树表明,绵羊DRB1与山羊、羚羊、塔尔羊和牛等物种DRB1氨基酸距离较近,具有高度同源性。

重庆地区汉族人群HLA-A、B、DRB1、DQB1等位基因多态性的研究

目的研究重庆地区人群HLA-A、B、DRB1和DQB1位点等位基因的多态性特点。方法采用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)技术对1 664名重庆籍健康人进行HLA-A、B、DRB1、DQB1等位基因的低分辨分型,并与国内其他地区汉族人群进行比较。结果本次研究共检出HLA-A、B、DRB1、DQB1位点等位基因62种,其中A位点14种,B位点27种,DRB1位点13种,DQB1位点8种。A位点中A*11(34.62%)、A*02(28.81%)、A*24(14.93%)、A*30(5.53%)为重庆人群的优势基因。B位点中B*46(14.92%)>B*40(12.96%)>B*13(12.39%)>B*51(7.26%)。DRB1位点中,频率最高的为DRB1*09(15.65%),其次为DRB1*12(14.78%)、DRB1*14(14.49%)、DRB1*04(14.49%)。DQB1位点中,频率最高的为DQB1*07(26.04%),其次为DQB1*05(19.94%)、DQB1*09(15.51%)。与其他地区不同人群相比,HLA-A、B、DRB1、DQB1各位点等位基因的分布均有显著的差异。结论重庆地区人群的HLA-A、B、DRB1、DQB1位点等位基因符合南方汉族人群分布特点,具有复杂的多态性,中国各地常见的基因均有分布,白血病及其他器官移植患者在重庆不难找到合适的供者。

中国美利奴羊MHC-DRB_1基因PCR-RFLP多态性分析

应用巢式PCR-RFLP方法,对211只中国美利奴(新疆军垦型)羊的MHC-DRB1外显子2的遗传多态性进行检测,并对基因型频率和等位基因频率进行了统计,结果表明,中国美利奴(新疆军垦型)羊的MHC-DRB1基因外显子2在SacⅠ、Hin1Ⅰ和HaeⅢ的酶切位点存在多态性,这些酶切位点分别受2、2和6个等位基因控制,由于MHC-DRB1为多碱基突变的基因位点,综合3种限制性内切酶的酶切结果,在中国美利奴(新疆军垦型)羊中共发现24种等位基因;χ2适合性检验结果表明,中国美利奴(新疆军垦型)羊的MHC-DRB1外显子2在SacⅠ和Hin1Ⅰ酶切位点均达到Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),但在HaeⅢ酶切位点未达到Hardy-Weinberg平衡(P<0.01)。

金堂黑山羊GoLA-DRB_3基因多态性与体尺性状相关性研究

采用TaqⅠ、PstⅠ和HaeⅢ三种限制性内切酶对111只金堂黑山羊GoLA-DRB3基因第二外显子的遗传多态性进行检测,结果表明:金堂山羊GoLA-DRB3第二外显子多态性极丰富,且为多碱基突变;除241位点外,第122、154、168和220几个位点的碱基突变均未达到Hardy-Weinberg平衡状态;TaqⅠ酶切的各基因型对胸围、管围影响达到显著水平(P<0.05);PstⅠ酶切的3种基因型间体长及管围差异极显著(P<0.01),HaeⅢ酶切的3种基因型对体高影响达到极显著水平(P<0.01)。

四川4个地方山羊品种(群体)MHC-DRB_3外显子2的多态性

采用TaqⅠ、PstⅠ和HaeⅢ限制性内切酶对四川4个地方山羊品种(群体)GoLA-DRB3基因第二外显子的特异性扩增产物进行消化。结果表明:山羊GoLADRB3第二外显子多态性极丰富,在122,154,168,220,241位点的碱基且为多碱基突变;X2适合性检验表明金堂黑山羊和富顺黑山羊GoLADRB3基因的第二外显子第122位点的碱基突变未达到HardyWeinberg平衡状态;4个山羊品种(群体)在第241位点的碱基突变均已达到HardyWeinberg平衡状态;金堂黑山羊、成都麻羊和乐至黑山羊在HaeⅢ酶切位点均未达到HardyWeinberg平衡状态。