牛抗病基因BoL A-DRB3的新等位基因的发现

BoLA-DRB3基因是主要组织相容性复合物(Major Histocompatibility Complex,MHC)基因家族中的Ⅱ类基因,它是该基因家族中最主要的功能基因,所编码的MHC抗原与免疫应答、抗病性密切相关。其第2外显子是编码抗原的主要功能区。本试验以地方良种鲁西牛、秦川牛、晋南牛和南阳牛为研究对象,采用PCR-RFLP方法对DRB3基因307bp的扩增产物进行多态性分析,结果表明DRB3基因第2外显子的第154位C→A,从而产生新的等位基因。经χ2适合性检验,鲁西牛在MHC-DRB3基因第2外显子的MspⅠ酶切位点未达到Hardy-Wein-berg平衡状态(P<0.05)。

多浪羊MHC-DRB3基因座的PCR-RFLP多态性分析

主要组织相容性复合体(MHC)是由紧密连锁的高度多态的基因位点所组成的染色体上的一个遗传区域,它在动物机体的免疫系统中发挥着非常重要的作用。应用PCR RFLP技术首次对多浪羊的MHC DRB3的外显子2进行分子遗传多态性检测与分析。结果显示,多浪羊MHC DRB3基因的外显子2在TaqⅠ、PstⅠ和HaeⅢ酶切位点存在多态,其酶切位点分别由2、2和6种共显性等位基因控制。综合3种酶切结果,本实验研究在多浪羊中检测到了DRB3基因的24种等位基因。

河西绒山羊DRB3基因外显子2多态性分析

研究采用PCR-SSCP方法检测1 046只河西绒山羊DRB3基因第2外显子的多态性,并克隆、测序群体内变异产生的各等位基因,分析各等位基因间的遗传关系和进化意义。结果表明,河西绒山羊DRB3基因第2外显子表现了18个等位基因(LG001-LG018)控制的31个基因型,LG005为优势等位基因,LG005*005为优势基因型,18个单倍型序列分析发现44个核苷酸多态位点、29个氨基酸多态位点;与GenBank下载序列比对分析结果表明,16个DRB3的等位基因是本研究首次发现;DRB3基因遗传多态指数中,观察杂合度为0.269 6,多态信息含量为0.869 9,有效等位基因数为1.369 1;经χ2适合性检验,该群体偏离了Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05);18个DRB3基因外显子2的单倍型序列NJ系统发育树呈2支分化趋势。研究认为河西绒山羊DRB3基因第2外显子具有丰富的遗传多态性;河西绒山羊DRB3基因最初由2个等位基因突变分化成两大类等位基因。

蒙古山羊和哈萨克山羊GOL A-DRB3基因的HaeⅢ酶切多态性分析

采用限制性内切核酸酶HaeⅢ对蒙古山羊和哈萨克山羊GOLA DRB3基因外显子2的285bp扩增产物进行了PCR RFLP多态性分析,共检测到17种基因型,由A、B、C、D、E、F和H等7个复等位基因控制;通过酶切图谱分析发现蒙古山羊和哈萨克山羊的GOLA DRB3基因外显子2的154、168和220位碱基表现出多态性。并对基因型频率和等位基因频率进行了统计分析,结果表明,GOLA DRB3基因的部分基因型频率和等位基因频率在两个群体之间差异显著(P<0.10或P<0.05)或极显著(P<0.01);χ2适合性检验结果表明,蒙古山羊和哈萨克山羊的GOLA DRB3基因外显子2的HaeⅢ酶切位点均未达到Hardy Weinberg平衡状态(P<0.01)。

4个绵羊品种MHC-DRB3基因外显子2的多态性分析

采用PCR-RFLP方法分析4个绵羊品种（阿勒泰羊、中国美利奴肉用多胎品系、湖羊和陶塞特羊）MHC-DRB3基因第2外显子的多态性,并进行聚类分析以及基因杂合度和多态信息含量的计算。结果表明：在绵羊MHC-DRB3基因第2外显子第122、154、168、220和241 bp碱基处表现出多态性;χ^2适合性检验结果表明,4个绵羊群体MHC-DRB3基因的第2外显子的PstⅠ酶切位点达到了Hardy-Weinberg平衡状态,TaqⅠ和HaeⅢ酶切位点多态性均未达到Hardy-Weinberg平衡状态;4个绵羊群体基因杂合度和多态信息含量值分别在0.693-0.774和0.662-0.738之间,表明4个绵羊品种具有丰富的遗传多样性;聚类结果表明,中国美利奴肉用多胎羊和湖羊亲缘关系最近,阿勒泰羊和陶塞特羊关系较远,与实际选育过程一致,MHC-DRB3多态性可作为绵羊育种标记进一步研究。

部分中国黄牛BoLA-DRB3基因序列分析

通过DNA测序,分别对4个中国黄牛地方品种的MHC-Ⅱ类基因DRB3外显子2的多态性进行分析。通过序列比对,共检测到DRB3*exon2等位基因259种,其中新等位基因131个。等位基因的分布具有品种特异性。各等位基因之间存在大量多态位点,统计分析表明:发生非同义替换的多态位点均主要分布在抗原结合位点对应的编码序列中,共有17个变异位点的氨基酸组成在品种间具有显著差异,其中7个位点差异显著(P<0.05);10个位点差异极显著(P<0.01)。在变异位点中,有8个位点为抗原结合位点。

巴什拜羊OLA-DRB3基因多态性与绵羊肺炎支原体感染相关性研究

本研究旨在分析巴什拜羊DRB3基因遗传多态性与MO感染的相关性。采用PCR-RFLP方法分析巴什拜羊OLA-DRB3基因第2外显子多态性,并计算基因杂合度、多态信息含量和有效等位基因数等遗传参数;通过分析和差异性检验MO阴性和阳性巴什拜羊OLA-DRB3基因型频率和等位基因频率,初步判定MO的抗性或易感性基因。结果表明:巴什拜羊OLA-DRB3第2外显子在第122、154、168和241碱基处表现出多态性;在Taq I、Pst I位点达到Hardy-Weinberg平衡,根据基因杂合度和多态信息含量,表明巴什拜羊具有较为丰富的遗传多样性。在巴什拜羊的24种基因型中,HaeⅢBC(P<0.05)为MO抗性基因,HaeⅢDD(P<0.05)为MO易感基因型;Pst I A(P<0.01)和Pst I B(P<0.01)、HaeⅢC(P<0.01)分别是巴什拜羊MO易感和抗性相关等位基因。此结果可为绵羊抗病育种研究提供理论支持。

大通牦牛DRB3.2基因的遗传多样性

为研究大通牦牛DRB3.2基因的遗传多样性,对69头大通牦牛的DRB3.2基因进行半巢式PCR扩增及序列测定,与GenBank下载的牛亚科其他群体对应基因序列进行比较分析。结果表明,大通牦牛DRB3.2基因在核苷酸组成上与其他牛种无明显差异,变异主要源于碱基的颠换,以T/G和C/G为主,等位基因多样性为0.991,平均核苷酸差异数为5.30,核苷酸多样性为2.01%,非同义替换与同义替换的比率(ω)为3.487 0,氨基酸分析结果表明发生变异的位点主要集中在该基因的抗原结合区及其相邻区域。正向检验结果表明,大通牦牛正受到强烈的正向选择,这种变异可能与该基因适应环境因子的特殊功能有关。

德昌水牛Bola-DRB3基因第二外显子的PCR-RFLP多态性研究

本研究应用PCR-RFLP方法,对德昌水牛MHCⅡ类基因座位的Bola-DRB3基因第2外显子进行了遗传多态性研究。结果表明:HaeIII酶切出现7种基因型,即AA、AB、AD、BC、AC、BF和BB,共有A、B、C、D、F 5个复等位基因控制;AA型的频率最高,为优势基因型,A基因为优势基因。RsaI酶切结果出现3种基因型,即GH、GG、HH,共有G、H 2个基因控制;GG的频率最高,为优势基因型,G基因为优势基因。这表明德昌水牛在Bola-DRB3基因第2外显子上具有丰富的多态性。在RsaI酶切位点上,德昌水牛未达到Hardy-Weiberg平衡状态,显示在群体中有选择、基因突变、近交、遗传漂变等因素的一定影响,这是对保种极为不利的,应引起畜牧工作者的关注。在德昌水牛遗传资源的开发利用和保存中,作者认为应严格划定杂交改良和保种区的范围;在杂交改良区内可以进行选育、品种间杂交,充分利用杂种优势,提高其生产性能;而在保种区或群中不进行杂交,同时减少选育;使德昌水牛遗传资源的有效保存和充分利用有机的结合起来。

荷斯坦奶牛BoLA-DRB3基因多态性与乳房炎相关性分析

本研究采用Hae Ⅲ和BstYⅠ内切酶,以PCR-RFLP方法分别检测了新疆地区引进的澳大利亚荷斯坦奶牛BoLA-DRB3基因的多态性及其与乳房炎的相关性。结果共检测到9种基因型5种等位基因,其中基因型HaeⅢAB和BstYⅠAA为优势基因型,等位基因HaeⅢA和BstYⅠA为优势基因;在高于健康牛的分布频率中,基因型Hae Ⅲ AB和BstYⅠAB,基因Hae ⅢB和BstYⅠA基因频率在感染牛中分布频率最高;在高于感染牛的分布频率中,基因型Hae Ⅲ AA和BstYⅠAA,基因Hae Ⅲ A和BstYⅠA在健康牛中分布频率最高。经χ2适合性检验,Hae Ⅲ酶切位点的碱基突变偏离平衡状态(P<0.01),而BstYⅠ酶切位点碱基突变达到平衡状态(P>0.05);Hae Ⅲ酶切基因型和基因频率在感染牛和健康牛中分布差异均极显著(P<0.01);BstYⅠ酶切基因型和基因频率在感染牛和健康牛中的分布差异均不显著(P>0.05)。

奶牛DRB3基因生物信息学分析

利用生物基因组学数据库,对奶牛MHCⅡ区DRB3基因进行生物信息学分析,以预测DRB3基因编码产物的理化性质、结构与功能,同时构建DRB3同源基因的系统进化树。结果表明,DRB3编码产物为不稳定亲水性蛋白,具有明显的信号肽,其切割位点位于29～30位的氨基酸之间。二级结构主要以无规则卷曲和延伸链为主,主要在细胞质中发挥生物学作用。序列分析表明,DRB3编码产物可能具有免疫应答、受体、胁迫应答、信号转导等功能,可能在免疫应答和胁迫应答过程中发挥重要作用,可能对奶牛免疫力和抗病性起关键作用。DRB3编码产物氨基酸邻接系统树表明,奶牛DRB3与绵羊、羚羊、塔尔羊、麝牛、亚洲水牛等物种DRB3氨基酸距离较近,它们具有高度同源性。

云南高峰黄牛BoLA-DRB3基因外显子2的PCR-RFLP多态性分析

通过PCR扩增获得云南高峰黄牛BoLA-DRB3基因第2外显子284bp的特异性条带,用核酸限制内切酶HaeⅢ,RsaⅠ,BstYⅠ和TaqⅠ对其进行消化分析。其中HaeⅢ酶切位点存在9种基因型,由A,B,D,E和F 5种复等位基因控制;RsaⅠ酶切位点存在46种基因型,由A,B,C,D,E,F,G,H,I,J,P,L,M,N,U,V,W和Y 18种复等位基因控制;BstYⅠ酶切位点存在10种基因型,由A,B、C,D和E 5种复等位基因控制;TaqⅠ酶切位点只出现了一种基因型。分析发现云南高峰黄牛DRB3基因第2外显子的61,70,94,104,124,150,154,163,173,182,202和217位的碱基表现出了多态性。经x2检验表明,BstYⅠ和TaqⅠ酶切位点已经达到了Hardy-Weinberg平衡状态,而HaeⅢ和RsaⅠ两个酶切位点未达到Hardy-Weinberg平衡状态。

北京荷斯坦母牛BoLA-DRB3基因外显子2的克隆与序列分析

采用PCR技术扩增出北京荷斯坦母牛BoLA-DRB3基因的外显子2的267 bp大小的片段,将该片段克隆到pGEM-T Easy质粒中,重组质粒用PCR和酶切分析进行阳性克隆鉴定,然后测定核苷酸序列,并推导其氨基酸序列.北京荷斯坦牛、蒙古牛、人类、瑞典红白花牛、蒙古绵羊、西班牙山羊之间DRB3基因外显子2的核苷酸序列同源性为80.9%～95.5%,氨基酸序列同源性为75.3%～91.0%.

中国荷斯坦牛BOLA-DRB3外显子2的PCR-SSCP多态性分析

通过PCR-SSCP法对中国荷斯坦牛BoLA-DRB3基因的外显子2进行多态性分析。在223个个体中共获得10种等位基因,其中D等位基因频率最高为0.2287,A等位基因频率最低为0.0135;等位基因型18种,其中FG基因型频率最高,为0.1256,其次为HH,基因型频率为0.1121;ML基因型频率最低,为0.0045。另外分析发现,在不同家系中,DRB3基因外显子2等位基因具有特异性,等位基因的类型和频率存在比较明显的差异。差异显著性分析表明,D等位基因对305d产奶量和305d乳蛋白量有明显的负效应,ME基因型个体305d乳脂量显著低于其他个体。结果表明中国荷斯坦牛的BoLA-DRB3外显子2具有丰富的多态性,并具有家系分布的特异性。

中国荷斯坦牛BoLA-DRB3基因的mRNA表达研究

为揭示牛MHC-DRB3上游调控区多态对其表达调控作用,利用PCR-SSCP和DNA序列测定技术分析并建立BoLA-DRB3*exon2和BoLA-DRB3 URR之间的连锁关系。结合不同近端调控区与转录因子结合模式预测结果,选择3种不同上游调控序列的连锁组合,应用实时定量RT-PCR技术对牛MHC-DRB3基因mRNA相对表达量进行了验证分析。结果表明,上游调控区基因型为H17H17的BoLA-DRB3基因mRNA相对表达量显著高于(P<0.01)基因型H1H1及H5H6。初步证明上游调控区中的多态会引起结构基因表达量的变化。

天祝白牦牛和甘南牦牛DRB3基因外显子2多态性研究

试验通过对天祝白牦牛和甘南牦牛DRB3基因外显子2部分CDS序列进行分析,获得其准确单倍型,通过直接测序与聚合酶链式扩增阻碍突变系统(ARMS)扩增法获得干净的单链,对高度杂合的双链进行分型。结果发现65个SNPs,1个密码子的插入缺失,获得30个单倍型,其中有7个单倍型是首次发现,应该是天祝白牦牛和甘南牦牛特有的单倍型。通过对已知牛属所有DRB3基因外显子2单倍型与本研究发现的单倍型进行分析发现天祝白牦牛和甘南牦牛分享普通牛和瘤牛单倍型,可能有普通黄牛和瘤牛的遗传背景,且DRB3基因外显子2的4、25、30、53、59、62、63、66、78氨基酸位点受到了正选择的影响,主要发生在天祝白牦牛群体里,这与天祝白牦牛长期选育白毛有一定的关系。

大额牛Bola-DRB3基因第2外显子的PCR-RFLP多态性分析

本文应用PCR-RFLP方法研究了大额牛MHCⅡ类基因座位的Bola-DRB3基因第2外显子的遗传多态性。结果表明:HaeⅢ酶切出现3种基因型,即NN、OO、NO,由N和Q两个等位基因控制;NO为优势基因型,O为优势基因。RsaI酶切也出现3种基因型,即PP、PQ、QQ,由P和Q两个等位基因控制;QQ为优势基因型,Q为优势基因,说明大额牛在有些基因位点上,特别是在Bola基因系统中还是具有较为丰富的遗传多态性;经X^2适合性检验表明两位点均符合Hardy-Weinberg平衡,这对保种是有利的。作者认为目前大额牛的保种应以传统保种方法为主,在泸水县、福贡县等地引种,异地纯繁成功的基础上,国家给予重点扶持,建立保种场和核心群进行重点保种;同时,应积极探索冻精、冻胚以及分子标记辅助保种和基因库保种等方法,加大生物技术保种的研究和应用力度;在必要的条件下建立大额牛冻精、冻胚的“基因库”,开展细胞工程、胚胎工程方面的研究,并探讨细胞核移植作为大额牛遗传资源保存的可行性和现实性。

荷斯坦奶牛BoLA-DRB3基因PCR-RFLP多态性分析

分别采用HaeⅢ和BstYI内切酶,以PCR-RFLP方法检测了新疆地区引进的澳大利亚荷斯坦奶牛BoLA-DRB3基因的多态性。结果显示:在HaeⅢ酶切分析中检测到6种基因型,3个等位基因,其中基因型AB频率最高,等位基因A为优势基因;在BstYI酶切分析中共检测到3种基因型,2个等位基因,其中基因型AA频率最高,等位基因A为优势基因。经χ2适合性检验,BoLA-DRB3基因的HaeⅢ酶切位点的碱基突变偏离Hardy-Weinberg(P<0.01)平衡状态,而BstYI酶切位点碱基突变达到Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。

多浪羊MHC-DRB3基因第二外显子序列分析

主要组织相容性复合体(Major Histocompitibility Complex,MHC)广泛存在于脊椎动物中,由于高度多态性在遗传育种和抗病性方面成为人们关注的热点。本实验用直接测序技术(DR)对23 只多浪羊DRB3 基因进行核酸序列分析。并用DNAMAN 分析序列共检测出46 个突变位点。结果表明,MHC-DRB3 基因在多浪羊中具有较高的多态性。

中国荷斯坦乳牛DRB3基因多态性的PCR-SSCP分析及其与泌乳性状的相关性

采用PCR-SSCP技术,对中国荷斯坦乳牛DRB3基因的多态性进行了分析,并用线性数学模型分析了各种基因型与乳牛乳腺炎的相关性。结果显示,DRB3基因有AA、BB和AB 3种基因型,其基因型频率分别为0.46,0.33和0.21;DRB3基因多态的产生是第88位产生A→T突变、第118位产生T→A突变以及第165位产生A→G的替换造成的;基因型频率分布的2χ值为19.56(P<0.01),DRB3基因的突变处于Hardy-Weinberg非平衡状态。相关性分析表明,不同基因型乳牛之间泌乳性状的差异不显著。