辣椒DREB转录因子鉴定及其在涝害胁迫下的表达分析

基于辣椒全基因组序列,对辣椒脱水响应元件结合因子(DREB)基因家族进行鉴定、系统分析、染色体定位,并对涝害胁迫下其表达特性进行研究。在辣椒基因组中鉴定出40个CaDREB基因,分布在12条染色体上,编码108~452个氨基酸。系统进化树分析结果表明,辣椒DREB基因分为3大类。胁迫数据分析结果表明,在涝害胁迫下,CaDREB家族中的一些基因表达发生变化。

沙鞭PvDREB基因克隆与表达特异性分析

基于沙鞭的三代转录组数据,该研究利用PCR技术克隆DREB基因,并对其进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR分析该基因的表达模式以及在20%PEG-6000模拟干旱胁迫处理下的表达特征,以探讨干旱胁迫下沙鞭DREB转录因子的功能和作用,为揭示PvDREB基因响应沙鞭的耐旱分子机制奠定基础。结果表明:(1)成功克隆获得一个沙鞭DREB基因,命名为PvDREB;PvDREB基因编码区长度831 bp、编码276个氨基酸,含有典型的AP2转录因子保守结构域;PvDREB蛋白是亲水性蛋白,不具有信号肽结构,存在跨膜结构和可能的糖基化及磷酸化位点。(2)系统进化分析显示,PvDREB基因与毛竹的DREB亲缘关系较近。(3)亚细胞定位预测表明,PvDREB蛋白定位于线粒体和细胞核中。(4)qRT-PCR显示,沙鞭根、茎和叶中PvDREB均可诱导表达但差异较大,且在茎中表达量最高,叶中次之,根中最低,具有明显的组织特异性;20%PEG-6000模拟干旱下,PvDREB基因在叶中的表达量随干旱胁迫时间增加而增加,12 h时达到最高,之后逐渐下降。研究推测,沙鞭PvDREB基因受干旱胁迫诱导表达,且该基因可能在沙鞭响应干旱胁迫的过程中起重要作用。

外源脱水应答转录因子DREB基因在转基因小麦中的诱导型表达与抗干旱生理效果研究(英文)

以冬小麦品种 8901、5-98、99-92和 104等品种的幼穗和幼胚为材料,用基因枪转化含逆境诱导转录因子 DREB 和bar 基因的质粒 pBAC128F(7 024 bp)。经筛选与植株再生,共获得 70 多个转基因小麦植株及其后代株系。转基因株系经PCR 分析和 RNA 点杂交检测,结果表明外源转录因子 DREB 基因已稳定整合到转基因植株及其后代株系中,并且在部分后代株系中获得了表达。叶片脯氨酸含量测定表明,有 16 个转基因株系的脯氨酸含量与非转基因对照相比,增加相当显著,其中10个株系的脯氨酸含量在1 100 μg/g以上,比对照提高了2倍多。室内抗旱模拟实验表明,转基因株系停止浇水15 d 后,叶片仍然表现绿色,而对照叶片则失绿、枯干;复水 10 d 后,转基因株系恢复活力,对照则死亡。研究表明,利用逆境诱导型启动子(rd29B)来增强外源DREB基因的表达,能显著改良小麦的抗旱性。

小麦转录因子TaDREB6基因的克隆及鉴定

为了克隆小麦干旱应答基因,构建了干旱诱导的小麦cDNA文库,并从文库中分离了一个DREB类转录因子基因TaDREB6。序列分析表明,TaDREB6具有一个837 bp的开放阅读框和242 bp的3'非编码区,推测的氨基酸序列中含有一个高度保守的AP2/EREBP结构域。采用该基因特异引物PCR技术对一套中国春缺体-四体材料进行扩增,将TaDREB6定位于3A染色体上,这是首次将一个小麦DREB基因定位在特定的染色体上。RT-PCR分析表明,TaDREB6基因受干旱胁迫诱导表达;亚细胞定位结果表明,TaDREB6-hGFP融合蛋白定位于细胞核中。上述结果说明,小麦TaDREB6基因编码的蛋白可能在细胞核内对干旱胁迫应答反应起调控作用。

胡萝卜2个DcDREB-A1类转录因子基因的克隆与比较分析

植物DREB类转录因子在植物抗逆性方面具有重要作用。本文以胡萝卜黑田五寸为材料,基于胡萝卜转录组数据,通过RT-PCR方法克隆出2个DREB-A1类转录因子基因Dc DREB-A1-1和Dc DREBA1-2。序列分析显示,这2个基因均没有内含子,长度分别为780bp和669bp,分别编码259和222个氨基酸;预测其蛋白质相对分子质量分别为29.0KD和24.71KD,p I值分别为4.32和4.63。通过对氨基酸亲水/疏水性进行分析,发现这2个转录因子属于亲水性蛋白。实时定量PCR分析表明,Dc DREB-A1-1和Dc DREB-A1-2基因在胡萝卜不同组织中的表达量不同,分别在叶和根中表达量最高。低温(4℃)、高温(38℃)、盐(0.2 mol·L-1Na Cl)、干旱(200 g·L-1PEG)不同时间段处理表达分析显示,Dc DREB-A1-1在低温、高温、盐和干旱胁迫下被显著诱导,高温、盐和干旱处理1 h后表达量达到最高,分别比对照增加14倍、7倍、7倍,低温处理下2 h表达量最高,是对照的18倍;而Dc DREB-A1-2在高温、低温和盐处理下响应明显,高温处理1 h后表达量为对照的12倍,低温和干旱处理下8 h基因表达量分别比对照增加2.4倍、6.2倍,说明2个基因在响应逆境胁迫时表达不同。胡萝卜响应非生物逆境胁迫是一个复杂的过程,本试验对深入研究胡萝卜抗逆分子机制,提高胡萝卜逆境抗性等方面具有较为重要的意义。

抗逆相关DREB转录因子的研究进展及应用

DREB转录因子即干旱应答元件结合蛋白,可以特异地与DRE顺式作用元件结合,在非生物逆境胁迫(干旱、低温、高盐)中激活胁迫诱导基因的表达,使植物能够耐受水分胁迫的影响。本文介绍DREB转录因子的结构特点和生物学功能,表达调控以及在抗逆基因工程方面的研究进展,同时对DREB转录因子在信号传递和调控网络方面的复杂性进行了讨论。

蒙古沙冬青AmDREB2C基因的克隆及表达分析

蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)是中国西北荒漠区唯一的常绿阔叶灌木,具有很强的抗寒抗旱特性。利用PCR方法从该植物克隆到转录因子Am DREB2C的c DNA和基因组DNA的全长编码区,二者均由1191 bp组成,无内含子序列,编码由396个氨基酸残基组成的蛋白,其中含1个AP2结构域和1个核定位信号。表达分析显示,Am DREB2C的转录受低温和干旱胁迫的诱导。此外,将该基因编码区c DNA成功构建到植物表达载体p CAMBIA3300-35ST上,为后续研究其功能奠定了基础。

植物DREB转录因子研究进展

DREB转录因子是重要的转录因子之一,在调控与逆境相关基因的表达、提高植物对逆境胁迫适应性中发挥重要作用。文章综述DREB转录因子的克隆、结构特点、表达、与植物逆境胁迫的关系、信号传导及在植物抗逆基因工程中的应用等的研究进展,指出该领域研究存在的问题如:其他多个逆境条件下DREB类转录因子的研究、受DREB直接调控的基因的特点及其调控机制、DREB自身和结构调控及其调控基因形成的表达调控网络,今后须针对这些问题进行深入研究,为提高作物抗逆性和选育抗逆作物品种奠定基础。

小麦DREB转录因子TaAIDFa的互作蛋白筛选

为进一步探讨DREB类蛋白的作用机理,以DREB类转录因子TaAIDFa为探针,利用酵母双杂交技术从cDNA文库中筛选TaAIDFa的互作蛋白,进而探讨DREB转录因子介导的互作网络,以初步阐明DREB转录因子的抗逆机制。结果表明,通过酵母双杂交从cDNA文库中筛选到84个克隆,对其进行测序和Blast序列比对分析,得到4类与TaAIDFa互作的候选蛋白。同源性分析发现,这4类候选蛋白多与信号转导或免疫过程有关,说明TaAIDFa参与了植物逆境胁迫下的信号转导,可调控与逆境胁迫相关基因的表达。

植物DREB转录因子研究进展

DREB转录因子在植物的非生物逆境胁迫(干旱、低温、高盐)中起着举足轻重的作用。综述了植物DREB基因的结构、功能及其克隆,并对DREB基因在植物抗逆基因工程方面的应用及其今后的研究方向进行了预测和展望。

转DREB基因烟草悬浮细胞系(BY-2)的建立及其几个与抗盐和抗渗透胁迫相关指标的检测

用基因枪法将DREB基因和诱导型启动子rd29B构建的载体pBAC128F转入烟草悬浮细胞。通过除草剂抗性筛选、PCR和PCR-Southern检测,获得转DREB基因的细胞系。以300mmol·L-1NaCl和15%PEG6000处理14d后,转基因细胞系存活并生长,而野生型则接近死亡。转基因细胞系的脯氨酸含量和超氧物歧化酶活性普遍高于野生型的,而丙二醛含量则相反。

海岛棉5个CBF/DREB基因的克隆与表达分析

低温、干旱和盐渍是影响作物生长、产量和全球地理分布的重要非生物胁迫。CBF/DREB转录因子是参与植物非生物胁迫应答反应的重要调控蛋白。为了更好地了解棉花CBF家族基因,通过生物信息学的方法,从海岛棉中克隆了5个具有完整开放阅读框的CBF基因,命名为Gb CBF1―Gb CBF5。这5个基因编码的蛋白与其他植物冷胁迫相关的CBF蛋白具有高度的保守性,含有1个AP2功能结构域和2个特征基序。系统进化树分析表明,这5个基因与拟南芥的3个参与冷胁迫的CBF基因一起聚类在DREB亚家族中的A-1亚组。通过RT-PCR的方法分析了海岛棉基因Gb CBF1―5在高盐(200 mmol·L-1 Na Cl)、干旱、4℃低温等非生物胁迫处理下的表达模式。结果表明其中2个基因在冷胁迫下上调表达,5个基因在干旱和盐处理下均下调表达。这些为进一步探索CBF基因在棉花逆境胁迫应激反应中的作用提供了有价值的信息。

大豆(Glycine max)GmDREB5互作蛋白GmGβ1的筛选及鉴定

从大豆（Glycinemax）中克隆了一个与抗逆相关的DREB（Dehydration Responsive Element Binding Protein）基因GmDREB5。功能分析证明,GmDREB5基因能够显著提高烟草的抗旱性和耐盐性。为了筛选GmDREB5的互作蛋白,采用酵母双杂交系统以GmDREB5蛋白73～226位氨基酸区段为诱饵筛选干旱处理的大豆cDNA文库,发现一个互作蛋白含有保守的WD40结构域,与棉花（Gossypium hirsutum）和水稻（Oryza sativa）的G蛋白β亚基分别具有61%和52%的同源性,说明蛋白可能是一类新的大豆G蛋白β亚基,将其定名为GmGβ1。将GmDREB5与GmGβ1共转化酵母菌株AH109,转化的酵母能够在四营养缺陷型培养基上（SD/trp^-leu^-his^-ade^-）正常生长,而对照不能生长;同时,共转化的酵母能够激活LacZ报告基因的表达,证明GmGβ1与GmDREB5之间存在相互作用。表达特性分析表明,GmGβ1基因受干旱、低温、高盐等胁迫和激素ABA处理的诱导而表达,证明GmGβ1不仅参与植物对非生物胁迫的响应,同时参与对GmDREB5蛋白水平的调控。

荧光实时定量PCR检测紫花苜蓿DREB基因的方法

建立一种简便、快速、有效的检测紫花苜蓿DREB基因表达水平的荧光实时定量PCR方法.优化检测DREB基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测体系.运用建立的优化体系检测了低温处理后紫花苜蓿DREB基因表达情况.

DREB基因双T-DNA植物表达载体的构建及验证

W 34基因经 pGEM T EASY载体 ,克隆到 pBDREB载体EcoRI位点 ,得到在Amp平板上生长的转化子 pBW 34-DREB质粒 ;质粒pBW 34-DREB、pSPROK、pBlueks分别经PstI/KpnI、KpnI/EcoRI、PstI/EcoRI双酶切 ,三片段连接构建成中间表达载体 pBWD Tnos;再用SmaI/EcoRV双酶切 pBWD Tnos,将回收的DREB基因的完整的表达结构元插入到经SmaI酶切的质粒载体 pCDMAR Hyg中 ,构建成双T DNA植物表达载体 pCDMAR pWDT Hyg ,大小为 13 5 9kb ,经酶切鉴定 ,证明构建的载体与预期设计的一致。将此双T载体用农杆菌介导法转化玉米胚性愈伤组织 ,期望得到无选择标记的安全的转基因植物。

沙冬青AmDREB3基因的克隆及植物表达载体构建

脱水应答元件结合蛋白(Dehydration-responsive element/DRE binding proteins,DREBs)属于植物AP2/EREBP(APETALA2/Ethylene-responsive element binding protein)转录因子大家族中的一个亚族,在植物对低温、干旱和盐碱等非生物胁迫的适应中起重要作用。本论文从强耐寒耐旱植物蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)中克隆到AmDREB3基因的编码区cDNA,对其编码蛋白的结构域和系统进化关系进行了分析,并将其成功构建到分别由CaMV35S和拟南芥rd29A启动子驱动的植物表达载体pCAMBIA3301上,为进一步通过转基因植物等方法验证该基因在耐逆性中的功能奠定了基础。

银中杨DREB基因的克隆及表达

【目的】克隆银中杨抗逆转录因子DREB基因,为其功能的深入研究奠定基础。【方法】根据DREBAP2/EREBP保守区设计1对简并引物,采用PCR方法对银中杨(Populus albaxp)转录因子DREB基因中间片段进行克隆;再利用反向PCR方法对该基因的旁侧序列进行克隆,最终将两侧序列与中间片段拼接得到基因全长;同时,根据基因序列设计1对特异引物,利用荧光定量PCR分析银中杨DREB基因在不同逆境胁迫中的表达情况。【结果】成功地从银中杨中克隆到1个DREB基因,命名为PaDREB(注册号:EF582843)。该基因序列长935bp,ORF为819bp,编码272个氨基酸;同源性比较与系统发育分析证实,银中杨DREB属于DREB转录因子家族,并与月季DREB2C具有较高的同源性;荧光定量PCR检测结果显示,盐、低温、干旱及ABA均能诱导DREB基因的表达。【结论】首次从银中杨中分离并克隆了DREB基因,并证实其参与了银中杨对盐、低温、干旱及ABA的应答。

小麦DREB基因的克隆及植物表达载体构建

脱水应答元件结合蛋白在高等植物应答干旱、高盐和低温胁迫中发挥重要的作用。根据GenBank中小麦(Triticum aestivum L.)DREB基因的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR技术从小麦中克隆了DREB基因837 bp的编码区。为进一步研究小麦DREB基因的功能,以pMD18-T-DREB质粒为模板,PCR扩增DREB基因片段,构建了该基因的植物表达载体。经菌液PCR和测序鉴定后,转化到农杆菌LBA4404中,为通过转基因技术深入研究小麦DREB基因的功能奠定了基础。

白腊DREB基因克隆中简并引物的设计

根据拟南芥DREB2A基因序列进行GenBank内Blastx序列同源性查询;对其中同源性较高的25个氨基酸序列进行了分析,设计简并引物,应用RT-PCR技术克隆白腊DREB2A基因,得到长2473bp、与拟南芥DREB2A同源性为96.94%的基因片段,并在GenBank登记,注册号为AY536056。

大豆(Glycine max)GmDREB5互作蛋白GmUBC13的特性及功能

【目的】鉴定大豆抗逆相关转录因子GmDREB5的互作蛋白,分析其互作蛋白GmUBC13的特性及其生物学功能,解析GmDREB5提高植物抗逆性的分子机制。【方法】通过酵母双杂交系统,以大豆GmDREB5的AP2功能域为诱饵对干旱处理的大豆cDNA文库进行筛选,获得GmDREB5候选互作蛋白后通过酵母互作及体外Pull-down试验确定GmDREB5与候选蛋白之间的互作关系;同时,分析互作蛋白GmUBC13的进化关系、蛋白结构及亚细胞定位等特性;通过半定量RT-PCR分析其互作蛋白GmUBC13在干旱、高盐、低温等非生物胁迫和激素ABA处理下的表达谱;通过转化烟草鉴定GmUBC13的生物学功能。【结果】通过筛选大豆干旱处理的cDNA文库获得一个GmDREB5互作蛋白GmUBC13(ubiquitin conjugating enzyme 13),GmUBC13属于泛素结合酶蛋白家族,GmUBC13含有UBCc保守域(ubiquitin-conjugating enzyme catalytic domain)、与泛素连接酶E3互作的氨基酸残基以及高度保守的半胱氨酸催化位点。进化树分析表明,GmUBC13的氨基酸序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana)含有16个成员的E2家族的第XV亚组的AtUBC13A、AtUBC13B以及水稻(Oryza sativa)的泛素结合酶蛋白Os01g0673600分别具有99%、97%和97%的同源性。酵母互作试验及体外Pull-down分析证明GmUBC13与GmDREB5蛋白之间存在相互作用。表达特性分析表明,GmUBC13受干旱、高盐、低温等非生物胁迫和激素ABA处理的诱导表达。GmUBC13在ABA的胁迫条件下,1 h开始有表达,10 h时表达量上升到最大,24 h稍微降低;在干旱和盐胁迫条件下,1 h开始表达,并随着胁迫时间的增长,表达量逐渐上升,24 h表达量达到最大;在低温胁迫条件下,GmUBC13受诱导较快,5 h表达达到最大,在10 h和24 h时未表达。蛋白亚细胞定位结果显示,GmDREB5蛋白定位在细胞核和细胞膜上,GmUBC13定位在细胞核中。基因功能鉴定结果证明,过表达GmUBC13的转基因株系GmUBC13-1、GmUBC13-2和受体对照W38的幼苗在正常MS培养基上的生长状态基本相似,在不同浓度PEG胁迫条件下,转基因株系GmUBC13-1、GmUBC13-2和W38烟草叶片叶绿素含量都降低,根长和地上部生长都受到抑制,而转GmUBC13烟草的叶片叶绿素含量降低缓慢,转基因烟草各株系的根长、地面长度均高于对照W38,且在8%PEG处理条件下,转基因株系GmUBC13-2的叶绿素含量、根长及地面长度与W38的差异达极显著。将生长2周的转基因烟草株系GmUBC13-1、GmUBC13-2与W38移至营养土中控水处理21 d,复水处理6 d后显示,转基因烟草株系生长情况明显优于非转基因对照W38,且转基因株系的存活率显著高于对照W38,表明在烟草中过表达大豆GmUBC13可以显著提高转基因烟草的抗旱性。【结论】大豆泛素连接酶GmUBC13与抗逆相关转录因子GmDREB5互作,GmUBC13受各种非生物胁迫处理诱导表达,在烟草中过表达可以显著提高植物的抗旱性。