用核基质结合区(SAR)序列提高小麦最小表达框转基因表达的稳定性

采用最小表达框技术转化植物可以规避由骨架序列引起的安全风险。核基质结合区序列SAR（scaffold attachment region）可作为边界元件与核基质结合阻挡转基因片段邻近染色质区的作用与影响,提高外源基因稳定性。本研究在最小表达框序列两端添加SAR序列,提高小麦最小表达框转基因表达的稳定性,提高转化基因的表达效率。首先,以GUS为目的基因构建带有SAR序列的最小表达框,以科农199为受体进行基因枪转化,同时以不加SAR序列的最小表达框片段为对照。带有SAR序列的最小表达框片段共轰击857个幼胚,T0代获得40株再生植株,PCR检测到16株阳性植株,转化效率为1.87%;对这16个阳性单株进行GUS染色,15株显色;从来自4个T0阳性植株的18个T1代植株中随机选取18株进行PCR和GUS染色检测,有15株表现为阳性。不带SAR序列的对照片段轰击1012个幼胚,获得31株再生植株,其中5株PCR阳性,转化效率0.49%,这5个阳性植株中仅2株为GUS染色阳性;来自于5个T0代PCR阳性株系的10个T1代单株中没有发现PCR和GUS染色阳性株。表明SAR序列可以提高基因枪转基因效率和目的基因表达稳定性。为了创制抗旱转基因小麦,以来自大豆的抗旱相关转录因子基因GmDREB3为目的基因,Bar基因为筛选标记基因,转化受体小麦济麦22,共轰击6045个幼胚,获得再生植株130株,PCR检测阳性植株30株,转化效率为0.50%;随机选取6株PCR阳性植株进行RT-PCR分析,其中5株可检测到外源基因的转录。进一步对这5株RT-PCR阳性植株插入片段完整性进行分析,其中4株插入片段基本完整。通过real-time PCR分析,发现T0代6个RT-PCR阳性植株的外源GmDREB3的拷贝数为1~3个。以上结果证明,在最小表达框两端加上SAR序列后可以提高小麦最小表达框转基因表达的稳定性。

大豆(Glycine max)GmDREB5互作蛋白GmUBC13的特性及功能

【目的】鉴定大豆抗逆相关转录因子GmDREB5的互作蛋白,分析其互作蛋白GmUBC13的特性及其生物学功能,解析GmDREB5提高植物抗逆性的分子机制。【方法】通过酵母双杂交系统,以大豆GmDREB5的AP2功能域为诱饵对干旱处理的大豆cDNA文库进行筛选,获得GmDREB5候选互作蛋白后通过酵母互作及体外Pull-down试验确定GmDREB5与候选蛋白之间的互作关系;同时,分析互作蛋白GmUBC13的进化关系、蛋白结构及亚细胞定位等特性;通过半定量RT-PCR分析其互作蛋白GmUBC13在干旱、高盐、低温等非生物胁迫和激素ABA处理下的表达谱;通过转化烟草鉴定GmUBC13的生物学功能。【结果】通过筛选大豆干旱处理的cDNA文库获得一个GmDREB5互作蛋白GmUBC13(ubiquitin conjugating enzyme 13),GmUBC13属于泛素结合酶蛋白家族,GmUBC13含有UBCc保守域(ubiquitin-conjugating enzyme catalytic domain)、与泛素连接酶E3互作的氨基酸残基以及高度保守的半胱氨酸催化位点。进化树分析表明,GmUBC13的氨基酸序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana)含有16个成员的E2家族的第XV亚组的AtUBC13A、AtUBC13B以及水稻(Oryza sativa)的泛素结合酶蛋白Os01g0673600分别具有99%、97%和97%的同源性。酵母互作试验及体外Pull-down分析证明GmUBC13与GmDREB5蛋白之间存在相互作用。表达特性分析表明,GmUBC13受干旱、高盐、低温等非生物胁迫和激素ABA处理的诱导表达。GmUBC13在ABA的胁迫条件下,1 h开始有表达,10 h时表达量上升到最大,24 h稍微降低;在干旱和盐胁迫条件下,1 h开始表达,并随着胁迫时间的增长,表达量逐渐上升,24 h表达量达到最大;在低温胁迫条件下,GmUBC13受诱导较快,5 h表达达到最大,在10 h和24 h时未表达。蛋白亚细胞定位结果显示,GmDREB5蛋白定位在细胞核和细胞膜上,GmUBC13定位在细胞核中。基因功能鉴定结果证明,过表达GmUBC13的转基因株系GmUBC13-1、GmUBC13-2和受体对照W38的幼苗在正常MS培养基上的生长状态基本相似,在不同浓度PEG胁迫条件下,转基因株系GmUBC13-1、GmUBC13-2和W38烟草叶片叶绿素含量都降低,根长和地上部生长都受到抑制,而转GmUBC13烟草的叶片叶绿素含量降低缓慢,转基因烟草各株系的根长、地面长度均高于对照W38,且在8%PEG处理条件下,转基因株系GmUBC13-2的叶绿素含量、根长及地面长度与W38的差异达极显著。将生长2周的转基因烟草株系GmUBC13-1、GmUBC13-2与W38移至营养土中控水处理21 d,复水处理6 d后显示,转基因烟草株系生长情况明显优于非转基因对照W38,且转基因株系的存活率显著高于对照W38,表明在烟草中过表达大豆GmUBC13可以显著提高转基因烟草的抗旱性。【结论】大豆泛素连接酶GmUBC13与抗逆相关转录因子GmDREB5互作,GmUBC13受各种非生物胁迫处理诱导表达,在烟草中过表达可以显著提高植物的抗旱性。