DREB1A转录因子蛋白的原核表达

DREB1A是DREB转录因子的一员,它们都含有一段与DNA结合的保守区域,由58个氨基酸组成,称为EREBP/AP2结构域(EREBP/AP2 domain)。一个DREB转录因子可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因表达。从拟南芥中克隆了DREB1A转录因子基因,成功构建了DREB1A基因的原核表达载体,转化E.coliBL21(DE3),经1 mmol/L IPTG诱导表达获得了DREB1A蛋白,但以包涵体形式存在。为以后深入研究DREB转录因子与DRE顺式作用元件相互作用的具体机制奠定了基础。

runt相关转录因子1在心血管疾病中的研究进展

runt相关转录因子1 (runt-related transcription factor 1,RUNX1)是一种转录因子,它广泛地参与到生物体细胞的增殖,分化等过程中,既往对它的研究主要集中在造血、肿瘤等方面。近年来,人们越来越关注它在心血管发育和心血管疾病中的潜在作用。本文将回顾近年来在心血管领域对RUNX1的研究,探讨它可能的作用机制,为今后的研究提供线索。

转录因子NbMYB1R1通过促进活性氧积累抑制病毒侵染

[背景]黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是我国重要的检疫性植物病毒,严重降低了世界范围内蔬菜以及瓜类的产量。MYB蛋白家族庞大,功能多样,存在于所有真核生物中。大多数MYB作为转录因子控制植物的发育和代谢,并对植物应对生物和非生物胁迫反应起重要的调控作用。前期研究显示CGMMV侵染后可以显著上调寄主转录因子基因NbMYB1R1的表达。[目的]明确NbMYB1R1参与CGMMV侵染的机制,为CGMMV病害防控提供理论依据。[方法]运用MEGA 7.0构建系统进化树,对NbMYB1R1的氨基酸序列进行系统进化分析;通过构建NbMYB1R1的荧光表达载体,转化GV3101农杆菌后浸润本氏烟叶片,激光共聚焦显微镜观察其亚细胞定位;利用qRT-PCR技术分析NbMYB1R1在CGMMV侵染不同时期的转录水平及NbMYB1R1沉默烟草植株中活性氧(reactive oxygen species,ROS)相关基因的转录变化;通过沉默NbMYB1R1及下游调控基因NbAOX1a和NbAOX1b,分析NbMYB1R1及下游调控基因NbAOX1a和NbAOX1b在CGMMV侵染过程中的作用;瞬时过表达NbMYB1R1和NbMYB1R1关键氨基酸突变体,分析NbMYB1R1对CGMMV侵染的影响;使用台盼蓝染色以及DAB染色观察瞬时过表达NbMYB1R1造成的细胞死亡是否与程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)以及ROS的积累有关;运用酵母双杂交技术验证NbMYB1R1是否与CGMMV相关蛋白互作。[结果]系统进化树分析表明,NbMYB1R1属于1R MYB大类并与多种烟草的MYB转录因子同源性极高;亚细胞定位结果显示NbMYB1R1定位于细胞核;在CGMMV侵染的烟草植株中,NbMYB1R1的转录水平对比健康植株有明显变化,在CGMMV侵染8、12 d时NbMYB1R1的转录水平显著上调;在沉默内源基因NbMYB1R1的植株上接种CGMMV,3 d后NbMYB1R1沉默植株系统叶出现斑驳、卷曲症状,而对照植株在3.5 d时才出现症状;同时CGMMV CP mRNA水平和蛋白水平检测结果也表明沉默NbMYB1R1可以有效促进CGMMV的积累;在本氏烟叶片瞬时过表达NbMYB1R1及其突变体3 d时检测CGMMV蛋白水平表达量,结果显示过表达NbMYB1R1可以有效抑制CGMMV的侵染,DNA结合结构域缺失后会减轻NbMYB1R1对CGMMV的抑制;台盼蓝和DAB染色结果表明,在瞬时过表达NbMYB1R1蛋白后导致ROS积累并引起细胞死亡;在沉默内源基因NbMYB1R1的植株叶片上检测ROS相关基因的转录水平,发现交替氧化酶基因AOX1a、AOX1b转录水平显著上调;在沉默内源基因NbAOX1a和NbAOX1b的植株上接种CGMMV,4 d后NbAOX1a和NbAOX1b沉默植株系统叶出现斑驳、卷曲症状,而对照植株在3.5 d时就出现症状;同时CGMMV CP mRNA水平和蛋白水平检测结果也表明沉默NbAOX1a和NbAOX1b可以有效抑制CGMMV的积累;酵母双杂交结果显示NbMYB1R1不与CGMMV编码蛋白直接相互作用。[结论]随着CGMMV侵染,防御相关基因NbMYB1R1表达上调,从而抑制下游基因AOX1a、AOX1b的表达并激活细胞内产生ROS抑制病毒侵染,但NbMYB1R1不是通过与CGMMV病毒蛋白直接互作而产生此作用。由此可见,NbMYB1R1在CGMMV侵染过程中发挥了重要作用。

LEC1等转录因子基因在花生小种子突变体种子发育过程中的表达分析

花生突变体ssm1与其对照亲本鲁花11号(LH11)相比,种子皱缩变小,百仁重、单株生产力和含油量显著降低。为了探究导致该突变体种子变小且含油量降低的原因,本试验研究了种子发育关键转录因子基因LCE1等在突变体ssm1及其对照LH11合子受精及种子发育不同阶段的表达情况。结果表明,AhLEC1在花生未受精子房(DBP0)时期表达量较低,且在ssm1和对照LH11中无明显差异,在受精后的子房(DBP1)和入土10 d(DAP10)和20 d(DAP20)种子中表达量上调,并且在LH11中的表达量极显著高于突变体ssm1;转录因子基因AhFUS3、AhABI3、AhAGL15和AhWRI1在ssm1中表达均有不同程度下调。其中,与脂肪酸合成和糖酵解关系密切的AhWRI1基因在ssm1中的表达量显著下调。因此推测,ssm1中AhLEC1基因的表达量显著下调,影响AhFUS3、AhABI3和AhWRI1等基因的表达,进而导致ssm1种子胚胎发育和油脂积累的异常。

自噬对锌指转录因子1及高糖诱导的肾小管EMT的影响

目的探讨自噬是否可以通过调控锌指转录因子1(Snail1)的降解而影响肾小管上皮细胞-间充质转化(EMT)过程。方法12只清洁级雄性SD大鼠,随机分为正常(NC)组、糖尿病(DM)组,予链脲佐菌素(STZ)53 mg/kg尾静脉注射复制大鼠Ⅰ型糖尿病模型;造模成功后第24周末处死NC和DM组大鼠,检测大鼠血糖、血尿素氮(BUN)和24 h尿白蛋白(24 hUAlb),Western blot检测肾组织自噬相关分子[自噬基因BECN 1(Beclin1)、微管相关蛋白1轻链3(LC3-Ⅱ/Ⅰ)、自噬降解底物蛋白1(p62)]、Snail1蛋白的表达水平;将大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)分为正常糖组(NG组)、高糖组(HG组)及高渗组(HM组),HG组培养的NRK-52E细胞在分为全蛋白组(Input组)和IP组[IP组又为阴性对照(IgG组)和实验组(Snail1/P62)];在高糖培养的NRK-52E细胞中分别使用自噬激动剂[雷帕霉素(RAP)和自噬抑制剂氯喹(CQ)]处理48 h,分为NG组、HG组、HG+RAP组及HG+CQ组,采用双标荧光腺病毒观察各组细胞的自噬流的情况,免疫荧光化学染色和免疫共沉淀观察Snail1与p62的蛋白相互作用,Western blot检测各组NRK-52E细胞中自噬相关分子、EMT、细胞外基质(ECM)指标表达变化;用二甲基亚砜(DMSO)、RAP、CQ处理NRK-52E细胞48 h,再联合放线菌酮(CHX)和蛋白酶抑制剂(MG-132)处理0、6及10 h,分为HG+DMSO/RAP组、HG+DMSO/CQ组,采用Western blot检测自噬对Snail1蛋白衰减的调控作用。结果与NC组相比,DM组大鼠血糖、BUN及24 hUAlb均增高(P<0.05);Western blot结果显示,与NC组比较,DM组大鼠肾组织及高糖培养的NRK-52E细胞中Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达下调(P<0.05),p62、Snail1蛋白表达上调(P<0.05);双标腺病毒实验显示,在高糖刺激的NRK-52E中自噬流受阻,与HG组相比,HG+RAP组NRK-52E细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)的蛋白表达增多,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、胶原蛋白Ⅲ(Col-Ⅲ)的蛋白表达减少(P<0.05),而HG+CQ组结果相反;免疫共沉淀实验发现Snail1与p62存在蛋白互作;联合CHX和MG-132后,HG+DMSO/RAP组中Snail1蛋白衰减速度加快。结论在DM大鼠肾组织和高糖培养的肾小管上皮细胞中,自噬受抑后使Snail1通过自噬降解减少,诱导EMT及ECM沉积增多,促进了肾脏纤维化的发生。

口腔鳞状细胞癌E2F转录因子1的表达与临床的意义

目的:探讨E2F转录因子1(E2F transcription factor 1,E2F1)在口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)中的表达和临床意义,并阐明其在细胞凋亡和周期中的作用。方法:基于R语言和癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)数据库分析OSCC中E2F1的表达和临床病理的相关性,通过基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)发现E2F1参与的主要生物学过程。蛋白质印迹法(Western blotting)和实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测E2F1在OSCC患者组织中的表达。通过细胞转染升高和敲低SCC15细胞系中E2F1的表达后,利用流式细胞术检测E2F1表达的改变对SCC15细胞凋亡和周期的影响。结果:E2F1在OSCC相关TCGA数据集中呈高表达,与T分期(T2或T4 vs T1)、组织学分级(G2或G3 vs G1)、临床分期(Ⅲ期vsⅠ期)、年龄(中年人vs青年人)和性别(男vs女)相关(P<0.05),多富集于细胞周期或核苷酸切除修复等基因组[P<0.05,错误发现率(false discovery rate,FDR)<0.25]。在37例OSCC患者组织中,E2F1的mRNA和蛋白均表达上调(P<0.001),表达上调的E2F1可降低SCC15细胞的凋亡率(P<0.05),以及在细胞周期中降低G1期的比率(P<0.01),并升高S期的比率(P<0.001)。结论:E2F1在OSCC中呈高表达,且可抑制细胞凋亡并促进细胞周期中G1/S期的转换。

长链非编码核苷酸膀胱癌相关转录因子1在咽部鳞状细胞癌中的研究进展

长链非编码核苷酸(long noncoding RNA, IncRNAs)是由200多个核苷酸组成的转录本,由于缺乏开放性阅读框架从而无法编码蛋白质。然而,lncRNAs以多种方式参与基因转录及转录后的多个层面,从而调控肿瘤的发生与发展。其中,长链非编码核苷酸膀胱癌相关转录因子1 (lncRNA BLACAT1)被证实通过与miRNAs竞争性结合、参与Wnt/β-catenin信号通路和STAT3信号通路以及作用于相关蛋白和分子,从而在恶性肿瘤的发生发展过程中起重要的作用。本文中,我们将概括lncRNA BLACAT1在咽部鳞状细胞癌中的作用机制,并预测其将来有望成为咽部鳞状细胞癌的新型生物标志物和治疗靶点。

猪转录因子YY1基因克隆、序列特征及真核表达载体构建

YY1(Yin-Yang1,YY1)作为重要的转录因子对基因表达调控起到重要的作用。本研究旨在克隆猪YY1基因CDS区序列,利用生物信息学软件分析猪YY1基因编码蛋白的特性和功能。利用免疫荧光检测YY1在猪卵泡颗粒细胞中的定位;利用同源重组构建YY1真核表达载体,通过qRT-PCR及Western Blot(WB)检测YY1过表达载体在猪原代卵泡颗粒细胞中的表达效率。本研究成功克隆了猪YY1基因全长CDS区,生物信息学分析结果表明猪YY1蛋白由411个氨基酸组成,相对分子质量为44.3 kDa,为亲水性与酸性蛋白,无跨膜结构域与信号肽,二级结构主要含有α-螺旋(16.06%)、延伸链(19.71%)、β-转角(7.54%)和无规则卷曲(56.69%),YY1主要定位于细胞核,共含39个潜在的磷酸化位点,互作蛋白有EP300、E2H2、HDAC1、HDAC2等。免疫荧光检测发现YY1主要在猪原代卵泡颗粒细胞的细胞核中表达,qPCR和Western Blot检测结果显示该真核表达载体在猪原代卵泡颗粒细胞中成功表达。本研究为进一步探究猪转录因子YY1的生物学功能及提高母猪的繁殖率提供了理论依据。

右美托咪定通过沉默信息调节因子1/核转录因子信号通路调控脑梗死大鼠海马组织炎症机制研究

目的:探究右美托咪定(Dex)干预对脑梗死大鼠的治疗效果及潜在治疗机制。方法:将60只SPF级SD雄性大鼠随机分为对照组、假手术组、模型组、右美托咪定低剂量组、右美托咪定高剂量组,每组各12只。除对照组、假手术组外,其余各组选用Longa线栓法制备大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,假手术组仅剥离肌肉血管。Dex治疗组分别腹腔注射盐酸右美托咪定溶液,其余各组注射等量0.9%氯化钠溶液。比较各组大鼠缺血脑组织的沉默信息调节因子1(SIRT1)、核转录因子(NK-κB)信使RNA(mRNA)和蛋白的相对表达水平及丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平,同时检测各组大鼠海马区炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)水平。结果:与对照组大鼠比较,Dex治疗组大鼠SIRT1mRNA和蛋白水平降低、NF-κBmRNA和蛋白水平升高,经Dex治疗后两组大鼠的SIRT1mRNA、蛋白水平升高,且Dex高剂量组更高;同时NF-κBmRNA、蛋白水平下降,且Dex高剂量组低于Dex低剂量组;与对照组、假手术组大鼠比较,其余各组大鼠TNF-α、IL-6、MDA水平升高,SOD水平下降,经Dex治疗后两组大鼠的炎性因子和氧化应激水平降低,且Dex高剂量组TNF-α、IL-6、MDA水平低于Dex低剂量组,同时SOD水平升高,且Dex高剂量组更高,差异具有统计学意义(均P<0.05)。结论:右美托咪定可能通过激活SIRT1/NF-kB信号通路,减轻炎性反应,缓解氧化应激,进而发挥脑保护作用。

拟南芥耐干旱相关转录因子DREB1A基因的克隆及序列分析

设计引物利用PCR技术从拟南芥中克隆与植物耐旱相关序列DRE相结合的转录因子DREB1A的基因,得到扩增谱带后,进行TA克隆,经蓝白斑筛选获得pDREB重组质粒,经PCR验证和序列测定确认扩增所得片段为DREB1A基因,并对该基因序列进行了分析.

种子休眠与萌发的关键调控因子DOG1的研究进展

DOG1(Delay of germination 1)蛋白是种子休眠的一种主要调控因子,可与ABA协同作用来延迟种子萌发。核心脱落酸(ABA)信号转导途径和DOG1途径在蛋白磷酸酶2C(PP2C)中汇聚。DOG1调控种子休眠需要PP2C,并通过与ABA过敏感萌发(AHG1/AHG3)结合来增强ABA的信号转导。DOG1抑制AHG1的作用来增加ABA的敏感性和诱导种子休眠。近年来,DOG1对种子休眠与萌发的调控研究取得了显著进展。本文对该领域的研究成果进行了综述,主要包括:DOG1对种子成熟、休眠与萌发的作用,DOG1表达的转录调控机制以及DOG1对种子休眠与萌发的调控及作用机制,最后提出了在本领域需要进一步研究的科学问题。

甲状腺乳头状癌组织中肿瘤转移相关基因1、叉头翼螺旋转录因子3水平变化与临床病理特征及淋巴转移的关系

目的:探讨肿瘤转移相关基因1(MTA1)、叉头翼螺旋转录因子3(FOXP3)在甲状腺乳头状癌(PTC)淋巴转移患者中的作用及临床意义。方法:选取手术治疗的111例PTC患者为研究对象,收集患者的癌组织及癌旁组织标本,采用免疫组织化学染色法观察组织中MTA1、FOXP3表达情况;采用多因素Logistic回归风险模型分析影响PTC淋巴转移的因素。结果:111例PTC组织标本中,MTA1的阳性表达率(MTA1阳性例数/癌组织总例数)为78.38%(87/111)高于癌旁组织17.12%(19/111),FOXP3在PTC组织中的阳性表达率(FOXP3阳性例数/癌组织总例数)为70.27%(78/111)高于癌旁组织13.51%(15/111),两组比较差异有统计学意义(均P<0.05);Spearman等级相关分析结果显示MTA1与FOXP3表达呈正相关(r=0.532,P=0.000);PTC患者癌组织中MTA1与FOXP3表达与包膜侵犯、淋巴结转移、TNM分期有关(P<0.05);单因素分析结果显示淋巴转移患者与未转移患者在性别、病灶数、包膜侵犯、TNM分期、脉管侵犯、MTA1及FOXP3等病理特征方面比较有统计学差异(均P<0.05);多因素Logistic回归分析结果显示性别、病灶、TNM分期、包膜侵犯及MTA1、FOXP3表达均是影响PTC淋巴转移的危险因素(均P<0.05)。结论:MTA1、FOXP3在PTC患者癌组织中表达均升高,其表达水平与包膜侵犯、淋巴结转移、TNM分期有关,可作为评估PTC淋巴转移的有效指标。

维吾尔族成人急性髓系白血病(非急性早幼粒细胞白血病)骨髓肾母细胞瘤基因1和转录因子ETS-1表达与预后的关系

目的检测维吾尔族成人急性髓系白血病(非急性早幼粒细胞白血病)[AML(非M3)]病人骨髓肾母细胞瘤基因1(WT1)和转录因子ETS-1表达水平,并探讨二者与AML(非M3)预后的关系。方法选取2015年6月至2018年10月喀什地区第一人民医院血液科收住的105例维吾尔族初诊AML(非M3)病人为观察组。选取同期于该院100例健康体检者为对照组A,及在该院治疗的100例汉族初诊AML(非M3)病人为对照组B。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测病人骨髓WT1基因和转录因子ETS-1的表达水平;多因素logistic回归分析AML的影响因素;采用Kaplan-Meier法描述生存曲线。结果观察组和对照组B白细胞计数明显高于对照组A(P<0.05),血小板计数及血红蛋白明显低于对照组A(P<0.05);观察组和对照组B病人白细胞计数、血小板计数、血红蛋白比较,差异无统计学意义(P>0.05)。观察组骨髓WT1、ETS-1表达水平分别为0.83±0.15、0.92(0.22,1.23),明显高于对照组B的0.35±0.14、0.48(0.24,1.01)和对照组A的0.01±0.01、0.02(0.01,0.03)(P<0.05),对照组B骨髓WT1、ETS-1表达水平明显高于对照组A(P<0.05)。logistic回归分析显示,WT1、ETS-1均是AML的危险因素;以AML(非M3)病人WT1、ETS-1中位数为界分为低表达组与高表达组,K-M显示WT1、ETS-1低表达组生存率高于高表达组(P<0.05)。结论维吾尔族成人AML(非M3)病人骨髓WT1和ETS-1水平呈高表达,且WT1和ETS-1高表达与疾病的发生及病人预后不良有关。

长链非编码核糖核酸KCNQ1重叠转录物1、Runt相关转录因子3与急性心肌梗死的关系

目的 探讨急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)患者血清长链非编码RNA KCNQ1重叠转录物1(long non-coding RNA KCNQ1 overlapping transcript 1,lncRNA KCNQ1OT1)、Runt相关转录因子3(Runt-related transcription factor 3,Runx3)表达水平及意义。方法 选取2019年1月至2020年4月在德阳市人民医院住院治疗的231例AMI患者为研究对象(AMI组),AMI患者按美国纽约心脏病协会心功能分级标准分为Ⅱ级组72例、Ⅲ级组81例、Ⅳ级组78例;同期选取229例健康体检者作为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction,fqRT-PCR)法检测血清lncRNA KCNQ1OT1、Runx3表达水平;酶联免疫吸附(ELISA)法检测氨基末端脑钠肽前体(N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes,CK-MB)、心肌肌钙蛋白(cardiac troponin,cTn)I、肌红蛋白(myoglobin,MYO)浓度;超声心动图检查左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)、左心室收缩末期内径(left ventricular end-systolic diameter,LVESD);分析AMI患者血清lncRNA KCNQ1OT1、Runx3表达水平与心功能指标的相关性;分析血清lncRNA KCNQ1OT1、Runx3表达水平对AMI的诊断价值;分析影响AMI发生的因素。结果AMI组患者lncRNA KCNQ1OT1(1.54±0.36 vs. 1.01±0.26)、LVESD[(52.68±6.74)mm vs.(42.73±6.52)mm]、LVEDD[(61.79±6.03)mm vs.(51.62±5.32)mm]、NT-proBNP[(292.23±34.27)ng/L vs.(96.27±23.42)ng/L]、CK[(746.82±210.55)U/L vs.(70.32±15.48)U/L]、CK-MB[(156.95±49.87)U/L vs.(1.25±0.37)U/L]、cTnI[(27.48±7.92)ng/mL vs.(1.13±0.26)ng/mL]、MYO[(678.94±159.78)ng/mL vs.(12.45±2.73)ng/mL]浓度高于对照组,Runx3(0.67±0.20 vs.1.02±0.24)、LVEF(43.26%±4.31%vs. 56.38%±5.12%)低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。心功能Ⅳ级组lncRNA KCNQ1OT1、LVESD、LVEDD、NT-proBNP、CK、CK-MB、cTnI、MYO高于Ⅲ级组和Ⅱ级组,Runx3、LVEF低于Ⅲ级组和Ⅱ级组,差异有统计学意义(P<0.05);Ⅲ级组lncRNA KCNQ1OT1、LVESD、LVEDD、NT-proBNP、CK、CK-MB、cTnI、MYO高于Ⅱ级组,Runx3、LVEF低于Ⅱ级组,差异有统计学意义(P<0.05)。血清lncRNA KCNQ1OT1、Runx3表达水平与病变支数、Gensini积分有关,且随着病变支数、Gensini积分增加,lncRNA KCNQ1OT1表达水平升高、Runx3表达水平降低(P<0.05)。AMI患者血清lncRNA KCNQ1OT1与Runx3表达水平呈负相关(r=-0.584;P<0.05);lncRNA KCNQ1OT1与LVESD、LVEDD、NT-proBNP、CK、CK-MB、cTnI、MYO呈正相关,与LVEF呈负相关(P<0.05);Runx3与LVESD、LVEDD、NT-proBNP、CK、CK-MB、cTnI、MYO呈负相关,与LVEF呈正相关(P<0.05)。血清lncRNA KCNQ1OT1、Runx3水平诊断AMI的曲线下面积(AUC)分别为0.859、0.743,特异度分别为81.6%、74.7%,敏感度分别为76.1%、78.3%;两者联合诊断的曲线下面积为0.901,特异度为92.0%,敏感度为73.9%。lncRNA KCNQ1OT1是影响AMI发生的独立危险因素(P<0.05),Runx3是影响AMI发生的保护因素(P<0.05)。结论 血清lncRNA KCNQ1OT1、Runx3参与AMI的发生、发展,二者表达水平对AMI的诊断可能具有重要意义。

偏肿革裥菌C2H2型转录因子SFP1基因克隆、生物信息学及表达分析

以L.gibbosa菌丝体总RNA反转录的cDNA为模板,通过RT-PCR克隆得到一个C2H2型锌指转录因子的cDNA序列。对该基因进行基因克隆、生物信息学分析,并利用实时荧光定量法对木屑处理下该基因的表达进行分析。通过保守结构域预测与结构分析发现该基因为裂指蛋白1类(SFP1)C2H2型锌指转录因子,具有2个C2H2家族的保守结构域,将该基因命名为Lg-sfp1。该基因CDS全长1947 bp,编码一个由648个氨基酸组成的亲水性膜内蛋白,蛋白大小为68.27 ku。通过SWISS-MODEL预测的三级空间结构发现两个完整的C2H2结构。木屑处理下Lg-sfp1基因表达比无木屑处理下表达量低,推断木屑促进了L.gibbosa氧化应激反应,当氧化应激反应大量发生时,参与氧化应激反应负调控的sfp1基因表达受到抑制,为后续研究偏肿革裥菌sfp1基因在木材降解,特别是氧化应激反应中的功能提供了理论基础。

核富集转录体1、肌细胞增强因子2D在子宫内膜癌中的表达及其与预后的相关性

目的研究子宫内膜癌(EC)中核富集转录体1(NEAT1)、肌细胞增强因子2D(MEF2D)的表达,探讨两者之间的相关性。方法以2016年3月至2018年3月延安市人民医院妇产科91例手术治疗EC患者的资料为研究对象。利用荧光定量PCR检测组织中NEAT1及MEF2D mRNA的表达,利用免疫组化检测组织MEF2D蛋白表达。以NEAT1、MEF2D mRNA相对表达量的平均数1.752、1.514为界,分别分为NEAT1高表达组(n=46)、NEAT1低表达组(n=45),MEF2D高表达组(n=44)、MEF2D低表达组(n=47)。Pearson相关分析NEAT1和MEF2D mRNA的相关性。Kaplan-Meier生存分析不同NEAT1、MEF2D mRNA表达与患者预后的关系。单因素及多因素COX回归分析影响EC患者预后的因素。结果荧光定量PCR结果EC癌组织中NEAT1、MEF2D mRNA的表达均高于癌旁组织(P<0.05)。EC癌组织中MEF2D蛋白阳性表达主要位于细胞核。EC癌组织中MEF2D蛋白阳性表达率为73.60%(67/91)明显高于癌旁组织21.98%(20/91)(χ^(2)=48.643,P=0.000)。不同肿瘤分期的EC患者NEAT1、MEF2D mRNA表达差异有统计学意义(均P<0.05)。NEAT1与MEF2D mRNA的表达呈显著正相关(r=0.591,P=0.000)。NEAT1高表达组和低表达组的3年总体生存率(OS)分别为71.74%(33/46)、88.89%(40/45);MEF2D mRNA高表达组和低表达组的3年总体生存率(OS)分别为70.50%(31/44)、89.36%(42/47),Kaplan-Meier分析(log-rank检验)表明:高NEAT1、MEF2D mRNA表达组生存率明显低于低NEAT1、MEF2D mRNA表达组患者(χ^(2)=5.318、5.420,P=0.021、0.018)。肿瘤FIGO分期Ⅱ期、NEAT1高表达、MEF2D mRNA高表达是影响EC患者不良预后的独立危险因素。结论EC中NEAT1、MEF2D表达升高,两者表达呈正相关,协同参与促进EC的疾病进展,是新的EC预后判断的肿瘤标志物。

新生儿支气管肺发育不良病儿外周血信号转导及转录活化因子3、内皮素-1表达及临床意义

目的探究新生儿支气管肺发育不良(BPD)病儿外周血信号转导及转录活化因子3(STAT3)、内皮素-1表达水平及临床意义。方法选取2019年3月至2021年3月唐山市妇幼保健院新生儿科收治的93例早产儿为研究对象,根据BPD诊治标准分为BPD组病儿51例,非BPD组病儿42例。收集所有病儿的一般临床资料并分析。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测病儿不同时期(出生后第1天、第14天、第28天)的血清STAT3、内皮素-1水平。受试者操作特征(ROC)曲线分析血清STAT3、内皮素-1对BPD的诊断价值。多因素logistic分析新生儿发生BPD的危险因素。结果BPD组与非BPD组病儿性别、产妇产前感染、院内感染之间的差异无统计学意义(P>0.05),胎龄、出生体质量、合并肺炎、合并贫血、呼吸暂停、宫内感染、动脉导管未闭、机械通气时间之间差异有统计学意义(P<0.05)。组间比较:BPD组病儿血清STAT3、内皮素-1水平第1天[(1.92±0.54)ng/L、(108.74±21.64)ng/L]、第14天[(1.43±0.37)ng/L、(83.16±16.34)ng/L]、第28天[(1.01±0.19)ng/L、(59.69±9.46)ng/L]均高于非BPD组[(1.16±0.25)ng/L、(65.16±10.62)ng/L,(0.98±0.18)ng/L、(54.34±9.11)ng/L,(0.80±0.16)ng/L、(46.78±7.84)ng/L],差异有统计学意义(P<0.05);组内比较:第14天、第28天两组病儿血清STAT3、内皮素-1水平均低于第1天,第28天两组病儿血清STAT3、内皮素-1水平均低于第14天,差异有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线分析显示,血清STAT3、内皮素-1对BPD诊断价值的曲线下面积(AUC)分别为0.83、0.85,截断值分别为1.65 ng/L、73.57 ng/L,灵敏度分别为60.80%、92.20%,特异度分别为95.20%、81.00%。多因素logistic回归分析显示合并肺炎、机械通气时间≥7 d及高水平的STAT3和内皮素-1是新生儿发生BPD的独立危险因素(P<0.05),而出生体质量1000~1250 g、>1250~<1500 g是新生儿发生BPD的保护因素(P<0.05)。结论BPD病儿血清STAT3、内皮素-1水平呈异常表达,且对新生儿发生BPD存在较高的诊断价值,血清STAT3、内皮素-1动态水平检测对及早发现BPD并早期干预治疗有重大意义。

淫羊藿苷通过上调TRIB1抑制核转录因子-κB缓解类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞炎症

目的:探讨淫羊藿苷(ICA)是否通过上调TRIB1表达抑制核转录因子-κB(NF-κB)缓解类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)炎症。方法:收集南昌大学第一附属医院接受膝关节置换手术的活动期类风湿关节炎(RA)患者的滑膜组织,分离培养RA-FLS后,用肿瘤坏死因子-α(TNF-α,10 ng·mL-1)处理RA-FLS建立炎症细胞模型。首先,为明确ICA抑制RA-FLS增殖和炎症,促进细胞凋亡,分为空白对照组、TNF-α组、TNF-α+ICA组;然后,为明确TRIB1过表达可抑制RA-FLS的增殖和炎症,促进细胞凋亡,空白vector或oe-TRIB1转染TNF-α处理的RA-FLS,分为空白对照组、TNF-α组、TNF-α+vector组、TNF-α+TRIB1组;接着,为明确ICA以依赖于TRIB1的方式抑制NF-κB,siTRIB1转染TNF-α处理的RA-FLS细胞,分为空白对照组、TNF-α组、TNF-α+ICA组、TNF-α+ICA+siTRIB1组。分别采用qRT-PCR、Western blot检测基因和蛋白水平;ELISA检测炎性细胞因子;CCK-8、流式细胞术检测细胞增殖和凋亡。结果:ICA处理和TRIB1过表达均抑制TNF-α诱导的RA-FLS的增殖和炎症反应,且促进其凋亡。TNF-α处理后RA-FLS中p-p65和p-IκB水平显著上调,但ICA显著降低p-p65和p-IκB水平;且与siTRIB1联合治疗时,ICA的抑制作用消失。结论:ICA通过上调TRIB1抑制NF-κB缓解RA,提示ICA可能是一种有前景的治疗RA药物。

甜菊耐寒相关基因SrDREB1As的克隆与转录因子特性分析

AP2/ERF转录因子家族中DREB亚族的A-1亚组基因对植物耐寒性具有显著的调控作用。本研究通过同源克隆的方法在甜菊中获得2个A-1亚组基因,分别命名为SrDREB1A1和SrDREB1A2(NCBI基因登录号分别为MK163640和MK163641)。SrDREB1A1 ORF全长660 bp,编码219个氨基酸残基,预测的蛋白分子量为24.58 kDa,等电点为5.42。SrDREB1A2 ORF全长630 bp,编码209个氨基酸残基,预测的蛋白分子量和等电点分别为23.21 kDa和5.41。进化树分析发现,SrDREB1A1和SrDREB1A2分别与紫茎泽兰的AaCBF及菊花的DgDREB1A亲缘关系最近,序列分析发现二者都具有一个典型的AP2结构域。进一步对蛋白功能研究发现,SrDREB1A1和SrDREB1A2都定位在细胞核并且具有转录激活活性。本研究将通过转基因手段为提高甜菊的耐寒性提供重要的基因资源。

转录因子DREB1A基因和Bar基因双价植物表达载体的构建及对马铃薯遗传转化的研究

马铃薯在生长发育过程中受各种生物和非生物胁迫的影响,干旱是其中最常见和危害最严重的非生物胁迫因素之一,常常导致单产不高,总产不稳,严重影响着马铃薯产业的发展。本研究以改善马铃薯抗旱性为目的,采用PCR方法从拟南芥中克隆了转录因子DREB1A基因和诱导型启动子rd29A。利用DNA重组技术成功构建了诱导型启动子rd29A驱动转录因子DREB1A基因和CaMV35S启动子驱动Bar基因的双价植物表达载体pBI121-rd29-BDR,并通过农杆菌介导法对马铃薯进行遗传转化,PPT筛选得到22株抗性苗,PCR和RT-PCR检测证明DREB1A基因已整合到陇薯10号马铃薯基因组中并在转基因植株中转录表达,有望提高转基因马铃薯的抗旱性。目前,作者正在进行转基因马铃薯的抗旱性分析研究。