DREB2A基因对苜蓿遗传转化的研究

以黑龙江紫花苜蓿Medicago sativa主栽品种:肇东苜蓿、敖汉苜蓿、公农1号和公农2号为受体材料,系统地探讨了除菌剂种类和浓度以及卡那霉素筛选浓度等,建立了高效的苜蓿再生体系和遗传转化体系;分别构建了由诱导型启动子rd29A和组成型启动子E12调控的DREB2A基因的2个植物表达载体pB2A29A和pB2AE12;采用农杆菌介导法进行遗传转化,获得大量转基因抗性植株并进行了分子生物学(PCR和Southern blot)检测。结果表明,DREB2A基因已整合到苜蓿基因组中。

基因枪共转化将拟南芥DREB2A基因和bar基因导入小麦

为了提高小麦的抗旱耐盐性,采用PCR方法克隆了拟南芥DREB2A(AtDREB2A)基因,构建了由水稻Actin启动子驱动的组成型表达载体,通过基因枪共转化途径,将AtDREB2A基因和抗除草剂筛选bar基因同时导入小麦品种Alondra和扬麦12,bar基因、AtDREB2A基因的转化频率以及两基因的共转化频率分别达到2.4%、0.4%和0.2%。对部分阳性植株进行RT-PCR分析表明,导入的AtDREB2A基因和bar基因均获得稳定表达本研究获得的共转化植株为今后剔除筛选标记基因。

毛白杨PtDREB2A基因的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

利用基因特异的PCR引物由毛白杨受干旱胁迫后构建的cDNA文库中扩增获得一PtDREB2A cDNA克隆,并进行测序和序列分析,结果表明:PtDREB2A cDNA片段总长为946 bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为864 bp,可编码长度为287个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列在AP2/ERF结构功能域与拟南芥AtDREB2A和水稻OsDREB2A蛋白的同源性分别为80.3%和83.3%。组织特异性Realtime-PCR结果显示,PtDREB2A在杨树根、茎、叶片和顶端分生组织中均有表达,但其表达模式不同:PtDREB2A在叶片表达丰度最高,在树干皮层及根部组织表达丰度中等,而在顶端分生组织及主干韧皮部、形成层与木质部表达丰度最低。非生物胁迫及激素诱导差异表达显示,PtDREB2A不仅受高温、低温、干旱与盐诱导表达,还受到激素IAA,NAA及GA3的上调表达,但与ABA的诱导无关。组合利用MEGA4.0和DnaSP4.50.4软件对毛白杨45株基因型个体的PtDREB2A序列进行比对和分析,共检测到49个单核苷酸多态性(SNP)位点,SNP频率为1/18 bp,多样性指数π为0.010 48。在外显子区域,共检测到46个SNP位点,其中19个为同义突变,27个为错义突变。

DREB2A基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

研究提取盐处理的拟南芥植株叶片总RNA,用DREB2A基因特异引物通过RT-PCR扩增出1050bp的片段,并将该片段克隆至pUC18上。序列分析结果表明,该克隆序列与GenBank上的DREB2A基因序列同源性达100%。进一步将DREB2A基因分别克隆至植物表达载体卡盒pCCE12和pCC29A上,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的DREB2A基因植物表达载体pCDRE12和pCDR29A。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为农杆菌介导的DREB2A基因对植物的遗传转化奠定基础。

拟南芥抗逆基因DREB2A转化大豆的研究

为提高大豆的耐旱耐盐碱性,将拟南芥转录因子DREB2A序列优化后,构建了植物表达载体pCAMBIA3300-DREB2A,利用农杆菌介导法将DREB2A基因导入大豆品种Willimas 82和Bert中,转化率分别为0.8%和3.2%。对抗性转基因植株进行PCR检测,2个品种分别获得阳性植株28和63株,表明DREB2A已整合到大豆基因组中。

逆境相关转录因子DREB2A转化紫花苜蓿的研究

以逆境性相关转录因子DREB2A为目的基因、除草剂抗性的bar基因为标记,构建了植物表达载体pCD2A,并通过农杆菌介导法以无菌苗子叶为外植体转化公农1号苜蓿。经过共培养、抑菌和筛选培养,在含有2 mg/L Basta的培养基获得71株抗性再生植株。用1 mg/L的Basta对抗性植株叶片进行进一步筛选,并经PCR检测,获得11株阳性植株,表明DREB2A已整合到植株的基因组中。

农杆菌介导法将DREB2A基因转入玉米

通过农杆菌介导法将耐盐基因DREB2A转入玉米自交系H99以及杂交种H99×A188中,同时研究了农杆菌浓度、侵染时间和AS浓度等因素对转化效率的影响。研究表明：农杆菌菌液浓度在OD值为0.5-0.6时农杆菌感染能力最强,适宜的侵染时间为20min;共培养基中乙酰丁香酮（AS）的适宜浓度为150μmol/L。通过该优化体系获得的转基因植株110株,经PCR分析鉴定,其中5株表现阳性,初步证明外源基因已经整合到玉米基因组中。

转录因子DREB2A植物表达载体构建及烟草转基因研究

构建转录因子DREB2A基因表达载体,通过叶盘法进行烟草的转基因表达研究。经过抗生素卡那霉素抗性筛选-PCR鉴定-Southern杂交检测,表明目的基因已经整合到烟草基因组DNA中。转基因植株出现生长迟滞现象。

拟南芥DREB2A基因的克隆及植物荧光表达载体的构建

以拟南芥幼苗总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增到DREB2A基因,并将其克隆到植物表达载体pCAM-BIA1304中CaMV 35 S启动子与poly(A)终止子之间。酶切鉴定及测序列结果都表明,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1304-DREB2A。另外,获得了携带DREB2A基因的根瘤农杆菌菌株,为以后转基因植物工作奠定了基础。

银中杨DREB2A基因RNA干扰载体构建及转化农杆菌的研究

应用Gateway技术体系替代传统载体构建方法,构建了银中杨(Populus albaxp)DREB2A基因的RNA干扰载体,并将其转入根癌农杆菌EHA105中。该RNAi表达载体的构建对进一步研究杨树DREB2A转录因子基因的功能具有重要意义。

不同水稻种质中渗透胁迫抗性基因DREB2A的遗传多样性分析

本研究旨在分析转录因子DREB2A基因在不同水稻种质中的遗传多样性,以期为水稻耐渗透胁迫遗传改良提供分子工具。利用单倍型分析、系统进化树、遗传距离和密码子偏好性分析,对85份不同类型水稻种质中DREB2A基因的功能性核苷酸序列变异及遗传多样性进行了研究。共鉴定出55个核苷酸变异位点,其中12个位于编码区,43个位于非编码区;鉴定出12个DREB2A等位基因型,其中来自非洲栽培稻(Oryza glaberrima)的3个等位基因型表现大片段变异;根据DREB2A基因的序列变异鉴定出39个单倍型,其中33个为新单倍型;将所有单倍型分为三组(Group Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ),其中非洲栽培稻(Oryza glaberrima)中的10个单倍型单独分为一组(Group Ⅲ);系统进化树、遗传距离和密码子偏好性分析均表明Group Ⅲ与其他两组具有较大差异。对85份不同类型水稻种质中DREB2A基因的序列分析表明,非洲栽培稻(Oryza glaberrima)中的DREB2A等位基因在序列变异、系统进化关系和密码子偏好性方面均明显不同于其他种质材料中的等位基因。

Drought Tolerance Enhancement with Co-Overexpression of DREB2A and APX in Indica Rice (<i>Oryza sativa</i>L.)

Rice is a major cereal crop providing food and energy to more than half of world’s population and drought is a challenging abiotic stress limiting rice production. Engineering drought tolerance trait is a major bottle neck because of multigenic control and complex nature. Two promising candidate genes utilized in engineering drought tolerance include DREB2A transcription factor (a master regulator of downstream stress inducible genes) and APX (an important ROS scavenging enzyme). Overexpression of DREB genes has shown encouraging results but with a negative impact on plant morphology and production. Moreover, co-expression of DREB2A and APX genes’ influence on drought stress has not been studied. Hence, in the present study, overexpression of single genes DREB2A or APX and co-expression of these genes were studied for enhancement of drought tolerance in indica rice. Both genes under control of CaMV 35S promoter were transferred by Agrobacterium transformation into rice variety BPT5204 popular for slender grains in South India. Confirmation of T-DNA integration into rice genome was done with PCR analysis of transgenes. Homozygous transgenic lines of DREB2A, APX and DREB2A-APX generated in T3 generation were evaluated for drought tolerance during seed germination, vegetative and reproductive stages. In seed germination stage, transgenic lines exhibited higher germination rates on 200 mM mannitol MS medium in comparison to WT. In vegetative stage, with-holding water for 7 days transgenic lines exhibited higher chlorophyll, proline, reducing sugars and enhanced activities of APX, SOD and catalase enzymes as well as reduced MDA content. The qRT-PCR analysis revealed higher relative transgene expression under drought stress. In reproductive stage, before maturity with-holding water for 7 days and restoring normal conditions, transgenic lines developed longer panicles and a higher number of grains/plant compared to WT. The overall results indicate that co-expression of DREB2A and APX can provide enhanced drought tolerance in rice plants to combat climate change conditions.

梭梭中HaDREB2A的克隆与表达分析

脱水响应元件结合蛋白(DREB)转录因子在应激反应相关基因的调控中起重要作用。本研究利用RT-PCR方法从梭梭组织中获得Ha DREB2A基因开放阅读框(ORF)全长(Gen Bank登录号为:KP765243)。生物信息学分析表明,该基因ORF长1 083 bp,编码360个氨基酸,蛋白的分子量为40.5 k D,理论等电点(p I)为5.07,该蛋白在90(K)~143(R)区域含有一个典型的AP2保守结构域。通过物种间系统发育树可以看出Ha DREB2A与Sb DREB2A进化关系最接近,二者属于同一进化分支。半定量RT-PCR表达模式分析显示,该基因在梭梭同化枝、根、茎、花和种子中均有表达,且在同化枝中的表达量最高,并且受干旱、高盐和外源ABA的诱导。

北方旱地红小豆DREB2A基因克隆及表达分析

脱水响应元件结合蛋白(DREB)转录因子在植物干旱和热胁迫应激调控中具有重要功能。为提高红小豆在北方干旱缺水条件下的产量,本研究以拟南芥DREB2A基因序列为依据,从红小豆基因组数据库中鉴定出了1个DREB2A的同源基因(Vigna angularis,登录号为XP_017429189.1)。经基因表达分析,结果表明:此基因为拟南芥DREB2A的直系同源基因,编码的蛋白不具有信号肽的作用,二级结构主要以无规则卷曲为主,而且含有多种逆境性转录因子。通过物种间系统进化树分析发现,该基因与红小豆DREB2A亲缘关系近的植物是沙冬青。荧光定量PCR技术分析结果表明,在红小豆非生物胁迫的调控中红小豆DREB2A也起到重要作用。本研究为阐释红小豆抗逆分子机制提供理论基础。

抗旱调控基因DREB2A转化辽荞5号的研究

通过农杆菌介导,将来源于干旱诱导下拟南芥的干旱调控基因DREB2A导入辽宁甜荞品种辽荞5号中,以提高其耐旱性。通过正交试验分析影响农杆菌转化的相关因素,建立并优化了转化体系。结果表明:(1)愈伤组织诱导过程中,选择子叶作为愈伤组织诱导受体,诱导愈伤培养基激素的配比为:2,4-D浓度为2 mg/L;6-BA浓度为1 mg/L;(2)农杆菌转化过程中,最适农杆菌OD600为0.5、侵染时间3 min、共培养3 d,乙酰丁香酮浓度100 mg/L、筛选培养羧苄霉素浓度50mg/L,草丁膦浓度100 mg/L;(3)通过对转化植株的PCR检测,印证了DREB2A基因已转化到辽荞5号中;(4)通过对转化植株的生理检测初步表明转基因荞麦比非转基因荞麦具有更高的抗旱性。

转录因子DREB1A和DREB2A调控机制的比较分析

DREB转录因子即干旱应答元件结合蛋白质,它能特异结合启动子中含有DRE/CRT顺式元件,激活许多逆境诱导基因的表达,增强植物对逆境的忍耐力。从DREB1A和DREB2A转录因子结构、功能、调控表达的基因以及蛋白稳定性等方面进行比较分析,为植物抗逆转录因子研究及应用提供依据。

组成型激活基因DREB2A载体的构建及其对烟草的遗传转化

为探索DREB2ACA基因(constitutive activate DREB2A,组成型激活DREB2A基因)在植物抗盐反应中的功能及其在植物抗逆基因工程中的运用,用SOE-PCR(overlapping extension-PCR,折叠延伸PCR)方法克隆了DREB2ACA,并将其置于盐诱导的rd29A启动子控制下,构建了植物表达载体,并通过农杆菌介导的方法将目的基因转入烟草。Southern blot证明了目的基因成功整合到烟草基因组中。RT-PCR表明,目的基因受盐胁迫诱导表达。在盐处理条件下,转基因烟草比对照具有更好的生长状态,含有较高的光和色素,具有较高的光合速率及较低的MDA含量。说明DREB2ACA的表达提高了植物抗逆能力,该基因在抗盐领域具有广阔的应用前景。

胡杨DREB2A和WRKY19基因启动子逆境响应元件及其功能分析

胡杨(Populus euphratica Oliv.)是唯一适应沙漠环境的高大乔木树种,抗逆性极强。其抗逆机制对植物抗性育种极为重要,国内外极为关注。本研究以生物信息学和转GUS基因烟草瞬时表达等手段解析胡杨PeDREB2A和PeWRKY19基因启动子序列顺式作用元件。结果表明,两个启动子均有干旱、NaCl、4℃、ABA响应顺式作用元件,CANNTG (N=A/T/C/G)、GRWAAW (R=G/A, W=A/T)、ACGT和CACATG等,增强GUS基因表达。PeDREB2A基因启动子序列1 886 bp,分别含干旱、盐、低温、ABA响应顺式作用元件等9个、11个、9个和5个;-888～-1 271 bp为盐负调控区,-1 271～-1 738 bp为干旱正调控区和ABA负调控区,-1 738～-1 878 bp为盐正调控区和干旱负调控区。PeWRKY19基因启动子序列为1 734 bp,分别含干旱、盐、低温和ABA响应顺式作用元件16个、5个、11个和4个;-176～-417 bp为盐负调控和ABA负调控区,-417～-696 bp为干旱负调控区和低温正调控区,-696～-849 bp为盐正调控区。本研究为阐释胡杨抗逆分子机制提供基础。

甘蔗转录因子DREB2基因的克隆和生物信息学分析

本文指出DREB转录因子广泛参与生物胁迫与非生物胁迫的应答反应,对提高植株在逆境中耐受性具有重要作用。本研究以甘蔗杂交品种为材料,利用同源基因克隆技术获得一个DREB2类转录因子基因ScDREB2。序列分析表明,ScDREB2基因长度为1537 bp,含有2个外显子和1个内含子,其中包括789 bp的开放阅读框(ORF),整个ORF编码262个氨基酸。生物信息学表明,获得的DREB2类转录因子等电点为9.25,相对分子质量为26861.97,分子式为C1238H1958N360O406S10。在二级结构预测中,α螺旋占比最高为42.75%,其次为无规则卷曲、延伸链、β折叠。基因的获得为下一步了解DREB2基因表达与甘蔗抵御非生物胁迫能力之间的关系奠定了基础。

白腊DREB基因克隆中简并引物的设计

根据拟南芥DREB2A基因序列进行GenBank内Blastx序列同源性查询;对其中同源性较高的25个氨基酸序列进行了分析,设计简并引物,应用RT-PCR技术克隆白腊DREB2A基因,得到长2473bp、与拟南芥DREB2A同源性为96.94%的基因片段,并在GenBank登记,注册号为AY536056。