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DsbC介导HCV优势抗原表位原核可溶性表达与间接ELISA分析
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作者 肖彭莹 黄国红 +3 位作者 王丽君 孙卫国 张灵霞 侯江厚 《国际检验医学杂志》 CAS 2023年第1期63-68,共6页
目的DsbC蛋白与丙型肝炎病毒(HCV)优势抗原表位原核融合表达并纯化,获得一种特异优良的HCV血清抗体诊断抗原。方法通过生物信息学软件,筛选我国HCV主要流行株优势抗原片段并进行串联融合形成组合肽命名为P367,将P367与DsbC蛋白进行融合... 目的DsbC蛋白与丙型肝炎病毒(HCV)优势抗原表位原核融合表达并纯化,获得一种特异优良的HCV血清抗体诊断抗原。方法通过生物信息学软件,筛选我国HCV主要流行株优势抗原片段并进行串联融合形成组合肽命名为P367,将P367与DsbC蛋白进行融合后在原核系统内可溶性表达并纯化获得重组抗原DsbC-P367,建立HCV-IgG血清学检测方法,通过对HCV阴阳性血清的检测,评价DsbC-P367与P367在血清学诊断差异,获得一种新型HCV-IgG血清学诊断抗原制作方法。结果通过信息学软件筛选获得的优势抗原表位来源于不同基因型,全长367个氨基酸。通过原核表达系统发现,DsbC-P367以可溶性表达形式存在,亲和纯化后其相对分子质量为63×10^(3),纯度为92%,Western blot实验初步证实重组DsbC-P367与P367蛋白均具有抗原性;对100份明确HCV阴阳性血清进行检测,DsbC-P367与P367灵敏度分别为96%、90%,特异度均为100%,与“金标准”比较,McNemer检验显示均P=1.00,Kappa分别为0.95、0.87,提示DsbC-P367相对于P367具有更优的灵敏度。结论重组获得的DsbC-P367融合肽在HCV血清学抗体检测中具有良好的灵敏度和特异度,可开发为HCV-IgG体外诊断试剂盒用于HCV感染的实验室诊断。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 抗原表位筛选 dsbc蛋白 间接酶联免疫吸附试验
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共表达TrxA和DsbC对富含二硫键的异源蛋白在大肠杆菌中表达的影响 被引量:4
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作者 刘志刚 林建波 +1 位作者 康铁军 俞炜源 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期486-489,共4页
以复制子为p15A的质粒pACU184为基础 ,构建了 3种表达硫氧还蛋白 (TrxA)或 和二硫键异构酶 (DsbC)的表达质粒 .经IPTG诱导 ,克隆的DsbC和TrxA都以可溶的形式高表达 .分别将构建的 3种表达质粒与复制子为colE1并克隆有人源化鼠抗人纤维... 以复制子为p15A的质粒pACU184为基础 ,构建了 3种表达硫氧还蛋白 (TrxA)或 和二硫键异构酶 (DsbC)的表达质粒 .经IPTG诱导 ,克隆的DsbC和TrxA都以可溶的形式高表达 .分别将构建的 3种表达质粒与复制子为colE1并克隆有人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体 低分子量尿激酶融合基因 (C6 UK)的表达质粒共转化大肠杆菌XL1 blue ,在 30℃用IPTG诱导表达 .SDS PAGE显示 ,共表达TrxA或DsbC都能导致C6 UK融合蛋白的部分可溶性表达 ,而且同时共表达TrxA和DsbC 2种分子时 ,C6 UK完全以可溶形式表达 ,但表达量降低 .分别用溶圈法和ELISA检测了各种共表达时可溶表达产物的生物活性 .结果显示 ,只有共表达DsbC时才能检测到明显的C6 展开更多
关键词 共表达 TrxA dsbc 异源蛋白 大肠杆菌 硫氧还蛋白 二硫键异构酶 低分子量尿激酶
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二硫键异构酶DsbC介导重组瑞替普酶在E.coli中可溶表达 被引量:3
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作者 禚孝发 关怡新 姚善泾 《高校化学工程学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2015年第3期600-606,共7页
瑞替普酶(reteplase)是第三代溶血栓药物,其结构中含有9对二硫键,因而重组瑞替普酶在E.coli中表达时极易形成包涵体。研究引入二硫键异构酶Dsb C介导瑞替普酶折叠过程中错配二硫键的异构,从而促进其在E.coli中的可溶表达。首先分别构建... 瑞替普酶(reteplase)是第三代溶血栓药物,其结构中含有9对二硫键,因而重组瑞替普酶在E.coli中表达时极易形成包涵体。研究引入二硫键异构酶Dsb C介导瑞替普酶折叠过程中错配二硫键的异构,从而促进其在E.coli中的可溶表达。首先分别构建了reteplase、Dsb C表达载体p BAD/His A-R及p ACYCDuet-1-Dsb C,并共转化入E.coli BL21菌株,获得了瑞替普酶的Dsb C共表达体系。在此基础上,考察了发酵过程中诱导方式及时间、培养温度、诱导剂浓度对瑞替普酶可溶表达量的影响。在37℃、200 r·min-1的条件下培养到OD600值为0.6左右时,加入0.1 mmol·L-1的IPTG诱导二硫键异构酶Dsb C的表达;在25℃、160 r·min-1的条件下培养1 h后,加入0.5 g·L-1的L-阿拉伯糖诱导目标蛋白瑞替普酶表达,继续培养10 h收获菌体,结果表明近60%的瑞替普酶实现了可溶表达,其产量约为70 mg·L-1发酵液,用平板溶圈法测得纯化后瑞替普酶的活性为2.35×105 IU·mg-1。通过共表达二硫键异构酶Dsb C实现了瑞替普酶在E.coli中的可溶表达,有助于瑞替普酶的临床及折叠机理研究,对其他富含二硫键的重组蛋白质生产具有一定的指导意义。 展开更多
关键词 瑞替普酶 二硫键异构酶 dsbc 共表达 可溶表达
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Stable RF transfer over a fiber-optic ring with DSBCS modulation and a DSB RF signal 被引量:1
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作者 师平洋 吴龟灵 +2 位作者 胡亮 李奇 陈建平 《Chinese Optics Letters》 SCIE EI CAS CSCD 2020年第2期10-14,共5页
We propose a radio frequency(RF)transfer technique with passive phase noise compensation over a fiber-optic ring.By adopting different frequencies and same wavelength transmission and double sideband(DSB)with carrier ... We propose a radio frequency(RF)transfer technique with passive phase noise compensation over a fiber-optic ring.By adopting different frequencies and same wavelength transmission and double sideband(DSB)with carrier suppression(DSBCS)modulation,the impact of backscattering can be effectively suppressed.A stable RF signal can be obtained via frequency mixing at an arbitrary access site along the fiber-optic ring.As the two directional transmissions adopt the same fiber and same wavelength from the same laser,the bidirectional propagation symmetry can be maximally guaranteed.We experimentally demonstrate 2 GHz RF signal transfer along a 100 km standard single-mode fiber-optic ring. 展开更多
关键词 frequency TRANSFER fiber LOOP link dsbcS MODULATION DFSW method
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鲍曼不动杆菌DsbC蛋白的原核表达及纯化 被引量:1
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作者 谢娜 钱云峰 +2 位作者 许卫国 雷蕾 李冉辉 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2020年第2期164-167,共4页
目的克隆鲍曼不动杆菌二硫键形成蛋白C(DsbC)基因,制备重组DsbC蛋白,为研究其活性奠定基础。方法通过NCBI获得DsbC蛋白序列,分析其生物学性质。采用PCR方法扩增无信号肽DsbC基因,并将其连接到表达质粒pET28a,构建重组质粒pET28a-DsbC,... 目的克隆鲍曼不动杆菌二硫键形成蛋白C(DsbC)基因,制备重组DsbC蛋白,为研究其活性奠定基础。方法通过NCBI获得DsbC蛋白序列,分析其生物学性质。采用PCR方法扩增无信号肽DsbC基因,并将其连接到表达质粒pET28a,构建重组质粒pET28a-DsbC,转化大肠埃希菌BL21(DE3)后用IPTG诱导DsbC蛋白的表达,采用镍离子亲和层析法纯化目的蛋白。结果 DsbC具有一个信号肽,由2个相同的DsbC蛋白分子构成二聚体。PCR扩增去掉信号肽的DsbC基因大小为636bp,构建的重组质粒pET28a-DsbC经PCR测序验证正确。重组质粒转化DE3后经IPTG诱导,表达分子质量单位为26.1×10^3的DsbC蛋白,经镍柱纯化得到单一电泳条带的重组蛋白。结论使用基因工程的方法表达并经镍柱层析得到高纯度的鲍曼不动杆菌DsbC蛋白,为进一步研究其活性奠定了基础。 展开更多
关键词 鲍曼不动杆菌 二硫键形成蛋白C 基因克隆 蛋白表达及纯化
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乳糖诱导瑞替普酶在大肠杆菌中的可溶性表达 被引量:4
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作者 田文静 罗学刚 +3 位作者 吕丽慧 倪萌 井晓兰 张同存 《中国生化药物杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期341-344,348,共5页
目的构建瑞替普酶(rPA)大肠杆菌基因工程菌,优化乳糖诱导表达条件,并获得活性重组蛋白。方法通过PCR扩增得到rPA编码基因,将该基因片段克隆到载体pET40b中,转化E.coli BL21。优化确定乳糖诱导浓度、时间、温度等参数,将诱导表达后获得... 目的构建瑞替普酶(rPA)大肠杆菌基因工程菌,优化乳糖诱导表达条件,并获得活性重组蛋白。方法通过PCR扩增得到rPA编码基因,将该基因片段克隆到载体pET40b中,转化E.coli BL21。优化确定乳糖诱导浓度、时间、温度等参数,将诱导表达后获得的菌体细胞通过超声破碎裂解后利用镍柱亲和色谱进行分离纯化,重组目的蛋白经Xa因子切割去除DsbC融合标签后释放获得rPA产物,最后利用纤维蛋白平板法对其溶栓活性进行检测。结果 rPA重组质粒构建成功,利用终浓度30 mmol/L的乳糖于30℃诱导5 h可以获得很好的表达效果,重组蛋白的表达量、可溶性及酶活与IPTG诱导产物基本接近;经纯化后的rPA目的蛋白可表现出明显的溶栓活性。结论本研究为进一步利用大肠杆菌系统表达生产高活性重组rPA提供了一定的参考依据。 展开更多
关键词 瑞替普酶 dsbc 乳糖 大肠杆菌 表达
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大肠杆菌二硫键形成相关蛋白的结构、功能及其在基因工程表达外源蛋白上的应用 被引量:11
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作者 张众 黄华樑 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第3期261-266,共6页
大肠杆菌分泌蛋白二硫键的形成是一系列蛋白协同作用的结果 ,主要是Dsb家族蛋白 ,迄今为止共发现了DsbA、DsbB、DsbC、DsbD、DsbE和DsbG。在体内 ,DsbA负责氧化两个巯基形成二硫键 ,DsbB则负责DsbA的再氧化。DsbC和DsbG负责校正DsbA导... 大肠杆菌分泌蛋白二硫键的形成是一系列蛋白协同作用的结果 ,主要是Dsb家族蛋白 ,迄今为止共发现了DsbA、DsbB、DsbC、DsbD、DsbE和DsbG。在体内 ,DsbA负责氧化两个巯基形成二硫键 ,DsbB则负责DsbA的再氧化。DsbC和DsbG负责校正DsbA导入的异常二硫键 ,DsbD则负责对DsbC和DsbG进行再还原 ,DsbE的功能与DsbD类似。除了直接和二硫键的形成相关外 ,DsbA、DsbC和DsbG都有分子伴侣功能。它们的分子伴侣功能独立于二硫键形成酶的活性并且对二硫键形成酶活性具有明显的促进作用。基于Dsb蛋白的功能特性 ,利用它们以大肠杆菌为宿主表达外源蛋白 ,特别是含有二硫键的蛋白 ,取得了很多成功的例子。本文简要介绍了这方面的进展 。 展开更多
关键词 大肠杆菌 二硫键形成相关蛋白 结构 功能 基因工程 表达 外源蛋白 应用
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胰管塑料支架和/或鼻胆管引流在内镜逆行胰胆管造影术选择性胆管插管困难时的应用研究 被引量:18
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作者 张艳 苏树英 费凛 《中国内镜杂志》 北大核心 2017年第2期10-14,共5页
目的探讨胰管塑料支架和/或鼻胆管引流在胆总管结石患者内镜逆行胰胆管造影术(ERCP)选择性胆管插管困难(DSBC)时的应用。方法回顾性分析57例ERCP术中DSBC的胆总管结石患者的临床资料,将患者分为胰管塑料支架组、鼻胆管引流组、胰管塑料... 目的探讨胰管塑料支架和/或鼻胆管引流在胆总管结石患者内镜逆行胰胆管造影术(ERCP)选择性胆管插管困难(DSBC)时的应用。方法回顾性分析57例ERCP术中DSBC的胆总管结石患者的临床资料,将患者分为胰管塑料支架组、鼻胆管引流组、胰管塑料支架+鼻胆管引流组,观察其手术成功率、术后并发胰腺炎、高淀粉酶血症或其他并发症的发生率,对比分析3组间的差异。结果接受ERCP的57例患者中,胰管塑料支架组13例患者,手术成功2例(15.4%),高淀粉酶血症1例(7.7%),术后胰腺炎2例(15.4%),发热1例(7.7%),出血1例(7.7%);鼻胆管引流组20例患者,手术成功20例(100.0%),无高淀粉酶血症及术后胰腺炎,无出血及发热等并发症的发生;胰管塑料支架+鼻胆管引流组24例患者1次ERCP手术成功19例(79.2%),2次ERCP成功5例(20.8%),4例出现高淀粉酶血症(16.7%),2例出现出血(8.3%),无发热及术后胰腺炎。3组间比较术后胰腺炎的发生和手术成功率差异有统计学意义。结论 ERCP术中DSBC的患者可通过放置胰管支架和/或鼻胆管引流术提高手术的成功率,减少胰腺炎的发生。 展开更多
关键词 胰管塑料支架 鼻胆管引流 内镜逆行胰胆管造影术 胆总管结石 选择性胆管插管困难
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双导丝术与早期经胰管乳头括约肌预切开术在困难性胆管插管ERCP中的应用 被引量:9
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作者 唐尚军 白梅 +5 位作者 王于梅 罗涛 邢明珍 谭向红 邓芳 余灏东 《吉林医学》 CAS 2019年第10期2207-2210,共4页
目的:探讨双导丝技术(DGT)与早期经胰管乳头括约肌切开术(TPS)在困难性胆管插管(DSBC)ERCP中的应用。方法:选取2013年1月~2019年1月在重庆市黔江中心医院行ERCP插管时DSBC患者152例,根据插管方法分为单导丝技术(SGT)组(对照组)、DGT组和... 目的:探讨双导丝技术(DGT)与早期经胰管乳头括约肌切开术(TPS)在困难性胆管插管(DSBC)ERCP中的应用。方法:选取2013年1月~2019年1月在重庆市黔江中心医院行ERCP插管时DSBC患者152例,根据插管方法分为单导丝技术(SGT)组(对照组)、DGT组和TPS组,比较3组患者插管时间、成功率及并发症发生率。结果:DGT组、TPS组的插管时间分别为(6.47±1.84)min、(5.29±2.01)min,显著低于SGT组的(8.17±2.34)min,差异有统计学意义(P<0.05)。DGT组、TPS组的成功率分别为84.45%、93.75%,显著高于SGT组(76.09%),差异有统计学意义(P<0.05)。DGT组术后并发症发生率12.07%,TPS组并发症发生率20.83%,SGT组并发症发生率30.43%,DGT组和TPS组与SGT组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:选择性胆管插管困难而导丝进入胰管时继续SGT成功率低且并发症发生率较高,经DGT、TPS均可有效提高插管成功率,且并发症发生率均相对较低。 展开更多
关键词 经内镜逆行性胰胆管造影术 困难性胆管插管 双导丝技术 经胰管乳头括约肌切开术 并发症
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巨细胞病毒gp52蛋白原核可溶性表达与应用 被引量:1
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作者 孙卫国 金程燕 +3 位作者 李邦印 张灵霞 刘艳华 程小星 《实用预防医学》 CAS 2013年第12期1419-1422,共4页
目的生物工程方法在原核系统内可溶性表达巨细胞病毒gp52蛋白并进行纯化,获得可以用于检测巨细胞病毒特异性抗体的重组抗原。方法利用PCR扩增获得巨细胞病毒gp52核酸序列,然后克隆至pET-DsbC核融合表达载体中,在原核系统进行诱导表达并... 目的生物工程方法在原核系统内可溶性表达巨细胞病毒gp52蛋白并进行纯化,获得可以用于检测巨细胞病毒特异性抗体的重组抗原。方法利用PCR扩增获得巨细胞病毒gp52核酸序列,然后克隆至pET-DsbC核融合表达载体中,在原核系统进行诱导表达并纯化,用Western blot和ELISA检测其抗原性及实用性。结果表达纯化的DsbC-gp52融合蛋白分别经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测60份抗巨细胞病毒IgM阳性血清和60份阴性血清。其中用酶标记DsbC-gp52蛋白建立的捕获ELISA法阳性检出率达96.6%,阴性检出率100%。结论融合蛋白DsbC-gp52在大肠杆菌中主要以可溶性表达形式存在,获得的高纯度融合蛋白抗原性和特异性强,利用其建立的IgM捕获ELISA方法,可用于临床检测风疹病毒的早期感染。 展开更多
关键词 巨细胞病毒 gp52蛋白 dsbc蛋白 可溶性表达
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Thermobifida fusca角质酶突变体D204C/E253C高效可溶表达及其应用
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作者 朱方剑 王蕾 +1 位作者 吴敬 陈晟 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期678-685,共8页
Thermobifida fusca角质酶突变体D204C/E253C是通过在野生型角质酶中引入二硫键获得的热稳定性突变体。由于二硫键的引入,导致突变体D204C/E253C在表达过程中,易错误折叠形成大量包涵体,可溶表达比率极低。这极大地限制了其发酵制备以及... Thermobifida fusca角质酶突变体D204C/E253C是通过在野生型角质酶中引入二硫键获得的热稳定性突变体。由于二硫键的引入,导致突变体D204C/E253C在表达过程中,易错误折叠形成大量包涵体,可溶表达比率极低。这极大地限制了其发酵制备以及在PET纤维改性中的应用。为了加强突变体D204C/E253C的可溶表达,本研究将突变体D204C/E253C和周质蛋白二硫键氧化还原酶DsbC在大肠杆菌突变株Escherichia coli Origami B(DE3)中共表达,来异构化异常的二硫键。实验结果表明,共表达的角质酶突变体D204C/E253C正常折叠表达,酶活为61 U/m L,是非共表达的6.8倍;共表达的突变体D204C/E253C在80℃的半衰期可达16 h,能够在80℃对PET纤维进行改性。本研究通过与分子伴侣蛋白DsbC在大肠杆菌突变株E.coli Origami B(DE3)中的共表达,实现角质酶突变体D204C/E253C的高效可溶表达,为大规模工业应用提供了一定的理论基础。 展开更多
关键词 角质酶 二硫键 可溶性表达 dsbc PET纤维改性
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脉冲升温-时间分辨中红外光谱研究蛋白质折叠动力学进展
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作者 李恒 柯慧敏 +3 位作者 任国平 叶满萍 翁羽翔 王志珍 《生物物理学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第S1期141-142,共2页
蛋白质的正确折叠构型是行使其生物功能的基础,也是生命正常运转的重要因素。蛋白质如何从氨基酸序列变成具有活性功能的结构是蛋白质折叠的基本问题。
关键词 蛋白质折叠 二体解聚 dsbc G49R 激光脉冲升温 稳态红外光谱 蛋白质盐效应
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