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DSPAα1缺失突变体在毕赤酵母中的表达及活性研究
1
作者
陈韵
牛纯青
+3 位作者
宋小双
苏畅
华子春
刘堰
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2016年第9期246-252,共7页
吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂(Desmodus salivary plasminogen activators,DSPAs)共有4种:DSPAα1、α2、β及γ。其中,DSPAα含有指形区(F)、表皮生长因子区(E)、kringle区(K)和丝氨酸蛋白酶区(P),DSPAβ含E、K、P区,DSPAγ含K和P区。以...
吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂(Desmodus salivary plasminogen activators,DSPAs)共有4种:DSPAα1、α2、β及γ。其中,DSPAα含有指形区(F)、表皮生长因子区(E)、kringle区(K)和丝氨酸蛋白酶区(P),DSPAβ含E、K、P区,DSPAγ含K和P区。以DSPAα1为基础,研究其结构对纤溶活性的影响。采用重叠延伸PCR技术(splicing overlap extension PCR,SOE-PCR)获得缺失E区的DSPAα1突变体(m DSPAα1),分别构建m DSPAα1/p PIC9K、DSPAβ/p PIC9K和DSPAγ/p PIC9K重组质粒并转化到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株GS115中表达,纤维平板法测活。结果显示未检测到DSPAγ的表达,DSPAα1活性为2.64×105 U/mg,DSPAβ的活性为1.32×104 U/mg,m DSPAα1活性为151.52 U/mg;同时使用DSPAα1、m DSPAα1、DSPAβ时,总活性几乎不受影响,单独使用任意两者时,发现活性均降低2-3倍。m DSPAα1纤溶活性几乎没有,同时DSPAβ与野生型DSPAα1相比保留了相当的催化活性。DSPAα1的N端区域可以影响其溶栓活性,而缺失E区后几乎丧失活性,说明E区在DSPAα1溶栓过程中起着至关重要的作用。
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关键词
dspaα1
SOE-PCR
缺失突变体
毕赤酵母
纤维平板法
下载PDF
职称材料
N-糖基化对毕赤酵母表达的DSPAα1分泌和活性的影响(英文)
被引量:
4
2
作者
李剑凤
阎岩
+2 位作者
王庆民
孙丽霞
王晶翼
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2010年第9期1287-1292,共6页
溶栓剂DSPAα1正处于治疗急性缺血性中风的III期临床研究,临床结果显示DSPAα1具有良好的药理学和安全特性。将DSPAα1基因序列按照毕赤酵母偏好密码子进行优化,并在毕赤酵母菌株GS115和KM71中进行表达,同时利用定点突变对糖基化侧链进...
溶栓剂DSPAα1正处于治疗急性缺血性中风的III期临床研究,临床结果显示DSPAα1具有良好的药理学和安全特性。将DSPAα1基因序列按照毕赤酵母偏好密码子进行优化,并在毕赤酵母菌株GS115和KM71中进行表达,同时利用定点突变对糖基化侧链进行缺失,考察糖基侧链对毕赤酵母表达DSPAα1的影响。结果表明,野生型DSPAα1在GS115和KM71中均获得高表达,在摇瓶发酵条件下,表达量分别为70mg/L和105mg/L;利用SDS-PAGE对DSPAα1三种突变体(N117Q、N362Q和N117Q/N362Q)进行分析,与野生型蛋白质相比较,3种突变体的表达水平显著下降,同时纤溶平板测活数据显示,纯化后的突变体N117Q和N362Q比活性均低于野生型蛋白质的25%。这表明,N-型糖链(N117和N362)对毕赤酵母表达的DSPAα1分泌和酶活性具有重要作用。
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关键词
N-糖基化
重组
dspaα1
毕赤酵母
原文传递
题名
DSPAα1缺失突变体在毕赤酵母中的表达及活性研究
1
作者
陈韵
牛纯青
宋小双
苏畅
华子春
刘堰
机构
重庆西南大学生命科学学院
南京大学医药生物技术国家重点实验室
出处
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2016年第9期246-252,共7页
文摘
吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂(Desmodus salivary plasminogen activators,DSPAs)共有4种:DSPAα1、α2、β及γ。其中,DSPAα含有指形区(F)、表皮生长因子区(E)、kringle区(K)和丝氨酸蛋白酶区(P),DSPAβ含E、K、P区,DSPAγ含K和P区。以DSPAα1为基础,研究其结构对纤溶活性的影响。采用重叠延伸PCR技术(splicing overlap extension PCR,SOE-PCR)获得缺失E区的DSPAα1突变体(m DSPAα1),分别构建m DSPAα1/p PIC9K、DSPAβ/p PIC9K和DSPAγ/p PIC9K重组质粒并转化到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株GS115中表达,纤维平板法测活。结果显示未检测到DSPAγ的表达,DSPAα1活性为2.64×105 U/mg,DSPAβ的活性为1.32×104 U/mg,m DSPAα1活性为151.52 U/mg;同时使用DSPAα1、m DSPAα1、DSPAβ时,总活性几乎不受影响,单独使用任意两者时,发现活性均降低2-3倍。m DSPAα1纤溶活性几乎没有,同时DSPAβ与野生型DSPAα1相比保留了相当的催化活性。DSPAα1的N端区域可以影响其溶栓活性,而缺失E区后几乎丧失活性,说明E区在DSPAα1溶栓过程中起着至关重要的作用。
关键词
dspaα1
SOE-PCR
缺失突变体
毕赤酵母
纤维平板法
Keywords
dspa
ctl
SOE-PCR
deletion mutants
Pichiapastoris
fibrin plate assay
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
下载PDF
职称材料
题名
N-糖基化对毕赤酵母表达的DSPAα1分泌和活性的影响(英文)
被引量:
4
2
作者
李剑凤
阎岩
王庆民
孙丽霞
王晶翼
机构
齐鲁制药有限公司药物研究院
出处
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2010年第9期1287-1292,共6页
文摘
溶栓剂DSPAα1正处于治疗急性缺血性中风的III期临床研究,临床结果显示DSPAα1具有良好的药理学和安全特性。将DSPAα1基因序列按照毕赤酵母偏好密码子进行优化,并在毕赤酵母菌株GS115和KM71中进行表达,同时利用定点突变对糖基化侧链进行缺失,考察糖基侧链对毕赤酵母表达DSPAα1的影响。结果表明,野生型DSPAα1在GS115和KM71中均获得高表达,在摇瓶发酵条件下,表达量分别为70mg/L和105mg/L;利用SDS-PAGE对DSPAα1三种突变体(N117Q、N362Q和N117Q/N362Q)进行分析,与野生型蛋白质相比较,3种突变体的表达水平显著下降,同时纤溶平板测活数据显示,纯化后的突变体N117Q和N362Q比活性均低于野生型蛋白质的25%。这表明,N-型糖链(N117和N362)对毕赤酵母表达的DSPAα1分泌和酶活性具有重要作用。
关键词
N-糖基化
重组
dspaα1
毕赤酵母
Keywords
N-linked glycosylation
recombinant
dspaα1
Pichia pastoris
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
原文传递
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
DSPAα1缺失突变体在毕赤酵母中的表达及活性研究
陈韵
牛纯青
宋小双
苏畅
华子春
刘堰
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2016
0
下载PDF
职称材料
2
N-糖基化对毕赤酵母表达的DSPAα1分泌和活性的影响(英文)
李剑凤
阎岩
王庆民
孙丽霞
王晶翼
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2010
4
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