miR-93-5p靶向DUSP8基因对糖尿病肾病足细胞损伤的影响

目的:观察miR-93-5p、双特异性磷酸酶8(Dual specificity phosphatase 8,DUSP8)对高糖诱导的人肾小球足细胞(HPC)损伤的影响,并探究其机制。方法:25mM高糖处理HPC细胞6、12、24 h,检测细胞的炎性因子白介素6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor-alpha,TNF-α)的分泌,细胞凋亡率及凋亡相关蛋白分裂的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved caspase-3)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,Bax)、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的表达,筛选最适处理时间12h。将miR-con组(转染miR-con)、miR-93-5p组(转染miR-93-5p mimics)、anti-miR-con组(转染anti-miR-con)、anti-miR-93-5p组(转染anti-miR-93-5p mimics)、高糖(HG)+si-con组(转染si-con)、HG+si-DUSP8组(转染si-DUSP8)、HG+miR-93-5p+pcDNA组(共转染miR-93-5p mimics和pcDNA)、HG+miR-93-5p+pcDNA-DUSP8组(共转染miR-93-5p mimics和pcDNA-DUSP8)用脂质体法转染至HPC细胞或高糖处理12 h的HPC细胞。分别使荧光定量聚合酶链式反应(Fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)实验、免疫印迹(Western blotting,WB)实验、酶联免疫吸附(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)实验、流式细胞术检测细胞miR-93-5p、DUSP8的表达、IL-6、TNF-α的分泌、DUSP8、Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2的蛋白表达、细胞凋亡率;双荧光素酶报告实验检测细胞的荧光活性。结果:与低糖(NG)组相比,HG(6、12、24h)组细胞miR-93-5p的表达显著降低,DUSP8表达显著升高,IL-6、TNF-α的含量显著升高,Cleaved caspase-3、Bcl-2的蛋白表达均显著降低,Bax的蛋白表达显著升高,细胞凋亡率显著升高,最适处理时间为12 h。过表达miR-93-5p抑制高糖诱导的HPC细胞IL-6、TNF-α分泌和凋亡率,并促进Cleaved caspase-3、Bcl-2蛋白,抑制Bax蛋白。miR-93-5p抑制野生型DUSP8细胞的荧光活性。沉默DUSP8具有与过表达miR-93-5p类似的保护足细胞损伤作用,过表达DUSP8则逆转过表达miR-93-5p对损伤足细胞IL-6、TNF-α分泌和凋亡的抑制作用。结论:miR-93-5p抑制高糖诱导足细胞炎性因子的分泌和凋亡,其机制与miR-93-5p靶向DUSP8相关。

DUSP8通过JNK/p38 MAPK通路来改善LPS诱导的巨噬细胞炎症反应

双特异性磷酸酶8(dual-specificity phosphatase 8,DUSP8)是双特异性蛋白磷酸酶家族的成员之一,被报道参与多个疾病发生过程。然而,DUSP8是否参与巨噬细胞等免疫细胞炎性应答过程,目前仍未有研究证实。本研究旨在检测DUSP8在脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞炎症反应中的表达,并探讨过表达DUSP8在巨噬细胞炎症反应的作用。利用100 ng/mL LPS刺激野生型C57BL/6小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow derived macrophage,BMDM),分别在不同时间点收取细胞,实时PCR和Western印迹检测发现LPS处理后,BMDM中DUSP8的表达水平明显降低(P<0.05),且在12 h达到最低值;随后,分别转染DUSP8过表达载体(DUSP8-EGFP)和对照载体(EGFP)于BMDM,Western印迹检测发现DUSP8-EGFP转染能够显著上调DUSP8的表达水平(P<0.05);进一步用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测发现DUSP8过表达使巨噬细胞表面分子CD80和CD86的表达显著下调(P<0.05);同时,中性红吞噬实验结果显示,DUSP8过表达后巨噬细胞的吞噬能力明显降低(P<0.05);此外,ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)检测结果显示,过表达DUSP8显著降低IL-1β,IL-6的表达水平(P<0.05);最后,Western印迹结果显示,JNK和p38 MAPK的磷酸化水平在DUSP8过表达组中明显降低(P<0.05)。以上表明,DUSP8过表达可显著改善LPS诱导的巨噬细胞炎症反应,其机制主要通过抑制JNK和p38 MAPK的活化。

罗格列酮保护氧糖剥夺复氧PC12细胞通过减少HMGB1释放和上调DUSP

目的探讨罗格列酮(rosiglitazone,RGZ)对氧葡萄糖剥夺/复氧处理后大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤(PC12)细胞的保护作用及机制。方法建立氧葡萄糖剥夺/复氧细胞模型,给予不同浓度罗格列酮及PPAR-γ特异性抑制剂GW9662,MTT法检测细胞存活率;ELISA法检测高迁移率族蛋白B1(HMGB1)浓度;Western blot法检测双特异性蛋白磷酸酶8(Dual-specificity Phosphotase,DUSP8)、Bcl-xl、PPARγ以及RAGE蛋白表达水平。结果OGD10h/R24 h后,DUSP8、Bcl-xl及PPARγ蛋白水平明显降低,RAGE和HMGB1水平明显增高(P<0.05);罗格列酮干预后,DUSP8、Bcl-xl及PPARγ蛋白水平明显增加,RAGE和HMGB1水平下降(P<0.05)。罗格列酮上调DUSP8、Bcl-xl及下调HMGB1、RAGE的作用可被GW9662有效抑制。结论罗格列酮通过上调PC12细胞OGD/R后的PPARγ蛋白表达,继而增加DUSP8和Bcl-xl抗凋亡蛋白的表达并减少晚期炎症介质HMGB1的分泌,是PPARγ激动剂保护氧糖剥夺复氧细胞的机制,PPARγ有望成为治疗脑缺血再灌注损伤的靶标。