DUSP9对高脂喂养胰岛素抵抗C57小鼠胆固醇、糖异生的影响

目的探讨DUSP9基因对高脂喂养诱导的胰岛素抵抗C57小鼠胆固醇、糖异生的影响。方法将成功构建的pEGFP-DUSP9裸质粒注射随机选取的高脂喂养小鼠(HD组,n=10),以空载pEGFP-N1注射的高脂喂养小鼠为对照(HE组,n=10),普食喂养的为阴性对照(NC组,n=10),质粒注射48h后分别取各组小鼠血清、肝组织,检测总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、空腹血糖(FBG),空腹胰岛素(FINS)等指标;实时荧光定量PCR(QPCR)法检测各肝组织中DUSP9、脂代谢相关基因固醇元件结合蛋白2(SREBP2)、低密度脂蛋白受体(LDLr)、糖异生关键酶-磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCK)mRNA表达的变化,Western blot法检测DUSP9蛋白表达水平。结果 HD、HE组小鼠FBG、FINS、TC、LDL-C水平较NC组明显升高(P<0.01);HD组小鼠肝脏中DUSP9mRNA、蛋白表达水平均较HE组显著升高(P<0.01),SREBP2、LDLr mRNA表达水平均显著增加(P<0.01),PEPCK mRNA表达水平明显下调(P<0.01);HD组小鼠48h血清TC、LDL-C水平与HE组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 DUSP9可能通过上调SREBP2、LDLr水平改善高脂喂养胰岛素抵抗C57小鼠的胆固醇代谢,减少PEPCK mRNA的表达水平从而导致肝糖输出减少,FBG水平降低。

P38MAPK、DUSP9在早发型重度子痫前期血清中的表达及意义

目的探讨早发型重度子痫前期患者血浆中P38MAPK、DUSP9的表达水平及其与早发型重度子痫前期的关系。方法选取重度子痫前期患者为研究组86例(其中早发型重度子痫前期患者44例、晚发型重度子痫前期患者42例),随机抽取同期45例正常妊娠者为对照组。采用采用酶联免疫吸附实验法检测外周血中P38MAPK、DUSP9表达水平。结果早发型重度子痫前期组血浆P38MAPK表达水平明显高于晚发组及对照组(95.13±6.86 pg/ml、80.26±4.27 pg/ml、71±5.08 pg/ml,均P<0.01),DUSP9血清中表达水平在早发型重度子痫前期组血浆表达水平明显低于晚发组及对照组(63.56±6.86 pg/ml、79.26±4.27 pg/ml、93±3.08 pg/ml,均P<0.01),Pearson相关分析显示,P38MAPK、DUSP9存在显著负相关,与IR(r=-0.62,P=0.001)。结论早发型重度子痫前期组P38MAPK显著高表达,DUSP9显著低表达,提示P38MAPK、DUSP9可能在早发型重度子痫前期疾病发生发展中起重要的作用。

DUSP9真核表达载体的构建及其在Hepa1-6肝细胞中的表达

目的构建小鼠DUSP9基因真核表达载体,并在小鼠Hepa1-6肝细胞中表达DUSP9蛋白。方法采用RT-PCR方法,从小鼠肝组织获取DUSP9cDNA片断,经双酶切、连接重组至真核表达载体pEGFP-N1,构建pEGFP-DUSP9重组质粒,双酶切及DNA测序对该重组质粒进行鉴定。脂质体介导pEGFP-DUSP9转染Hepa1-6肝细胞,实时荧光定量PCR、Western blot检测DUSP9mRNA及蛋白表达水平的变化。结果 pEGFP-DUSP9重组质粒经双酶切及测序鉴定证明构建完全正确,成功转染Hepa1-6肝细胞并高效表达,检测到明显上调的DUSP9mRNA和蛋白表达水平。结论成功构建真核表达载体pEGFP-DUSP9,并在Hepa1-6肝细胞中表达了DUSP9蛋白,可为研究DUSP9的生理功能及了解其在糖、脂代谢、胰岛素抵抗进程中的作用奠定坚实的基础。

DUSP9、P38MAPK在早发型重度子痫前期患者胎盘组织中的表达及意义

目的探讨P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)及双特异性磷酸酶9(DUSP9)与早发型重度子痫前期发生发展的关系,揭示其与细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)1/2信号通路相互作用机制,为早发型重度子痫前期的发病机理提供理论依据。方法收集122例重度子痫前期患者为研究组(其中早发型62例,晚发型60例),随机抽取同期65例正常妊娠者为对照组。采用免疫组化方法检测胎盘组织中P38MAPK、DUSP9的表达水平。结果各组胎盘组织的合体滋养细胞、蜕膜细胞、血管内皮细胞中均可检测到P38MAPK、DUSP9的表达。早发型重度子痫前期组P38MAPK表达显著高于晚发型重度子痫前期组及对照组(0.112±0.025,0.072±0.002,0.048±0.008,P<0.01);早发型重度子痫前期组DUSP9表达水平显著低于晚发型重度前期组及对照组(0.041±0.004,0.078±0.002,0.126±0.008,P<0.01);各组胎盘组织中P38MAPK与DUSP9的表达水平呈负相关(r=-0.53,P<0.05)。结论早发型重度子痫前期组胎盘中P38MAPK高表达及DUSP9低表达与其疾病的发生发展密切相关。提示P38MAPK、DUSP9/ERK1/2信号通路可能相互作用,并共同在早发型重度子痫前期发生发展中起重要作用。

利用CRISPR/Cas9技术建立小鼠Bdh2、Dnmt3a和Dusp9敲除新型胚胎干细胞系

胚胎干细胞因其具有体外自我更新以及多向分化的能力,成为研究基因功能、细胞治疗和组织再生等的有力工具.胚胎干细胞的基因敲除模型在基因功能研究中起着重要作用.我们利用实验室现有的G3-AH和tWG3II-2两种胚胎干细胞系,通过脂质体转染嘌呤霉素(puromycin)标记的PX459-sgRNA载体,使用CRISPR-Cas9技术分别构建Bdh2、Dnmt3a和Dusp9敲除的胚胎干细胞系,通过基因型鉴定、PCR产物测序、qPCR和Western Blot等实验得到Bdh2、Dnmt3a和Dusp9纯合缺失的胚胎干细胞系.之后,qPCR、免疫荧光染色分别检测了Bdh2、Dnmt3a和Dusp9缺失的胚胎干细胞中多能基因、DNA甲基化相关基因和胚层分化相关基因表达变化.另外,通过嵌合体制备方法检测Dusp9基因敲除对胎儿卵黄囊(yolk sac)和胎盘(placenta)等发育的影响.实验结果表明,KO细胞系中分别敲除的基因(Bdh2、Dnmt3a和Dusp9)在mRNA水平和蛋白水平的表达均显著降低(p<0.05),且不同程度地影响了DNA甲基化相关基因和胚层分化相关基因的表达.Dusp9KO嵌合体结果显示,Dusp9KO均能贡献到胎儿及卵黄囊,但是,能否贡献到胎盘尚待进一步深入探究.本研究成功获得纯合敲除Bdh2、Dnmt3a和Dusp9基因的胚胎干细胞系,为研究Bdh2、Dnmt3a和Dusp9三种基因在胚胎干细胞中的作用提供了重要依据.

DUSP9基因多态性与子痫前期和母婴结局的关系

目的分析双特异性磷酸酶9(DUSP9)基因rs5945326位点多态性与子痫前期和母婴结局的关系。方法选取2016年1月-2020年6月就诊的孕晚期子痫前期患者100例为子痫前期组,同期孕晚期正常孕妇100例为对照组。检测DUSP9基因rs5945326位点多态性,比较两组孕妇基因型频率和等位基因频率差异,比较DUSP9不同基因型母婴结局。结果两组DUSP9基因rs5945326位点基因型和等位基因频率比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。GG组、GA组、AA组患者收缩压、舒张压、24 h尿蛋白水平比较差异均有统计学意义(均P<0.05),GG组患者收缩压、舒张压、24 h尿蛋白水平最低。GG组、GA组、AA组患者妊娠结局和新生儿结局比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论DUSP9基因rs5945326位点单核苷酸多态性与子痫前期患者病情严重程度和母婴结局均存在密切关系,发生A突变后,患者存在病情严重和分娩结局不理想的风险。

DUSP9基因多态性与妊娠期糖尿病的相关性研究

目的探讨双特异性磷酸酶9(dual specificity phosphatase 9, DUSP9)基因rs5945326位点单核苷酸多态性与妊娠期糖尿病(diabetes gestational mellitus, GDM)及相关临床指标的关系。方法应用基因测序技术,检测成都地区206例GDM孕妇(GDM组)和189名正常孕妇(对照组)DUSP9基因rs5945326位点多态性,比较GDM孕妇和正常孕妇基因型频率和等位基因频率,并比较不同基因型的血糖、血脂、体质指数等临床指标。结果GDM组DUSP9基因rs5945326位点AA、AG、GG基因型频率分别为32.2%、52.2%、15.6%,对照组分别为41.2%、43.9%、15.0%,两组比较差异无统计学意义(χ^2=3.601,P=0.165);GDM组A、G等位基因频率分别为58.3%、41.7%,对照组分别为63.1%、36.9%,两组比较差异也无统计学意义(χ2=1.894,P=0.188)。DUSP9基因rs5945326位点GG基因型高密度脂蛋白水平[(2.34±0.61) mmol/L]高于AG+AA基因型[(2.06 ± 0.56) mmol/L],差异有统计学意义(t=2.993, P=0.003);不同基因型间其它临床指标的差异均无统计学意义(P>0.05)。结论DUSP9基因rs5945326位点单核苷酸多态性可能与成都地区GDM发病无相关性,但与高密度脂蛋白水平密切相关。