猪DUXA基因克隆及过表达载体的构建

收集猪体外受精(IVF)和体细胞核移植(SCNT)的2-细胞、4-细胞、8-细胞和16-细胞时期的胚胎,对各细胞阶段DUXA基因的表达进行比较分析;提取猪卵巢的RNA后通过RT-PCR克隆得到DUXA目的基因,对DUXA基因进行生物信息学分析;将目的基因片段连接至pCDNA3.1-EGFP载体中,再将载体转染至293T细胞中。结果显示,与IVF胚胎相比,DUXA基因在SCNT胚胎中的表达滞后;克隆的DUXA基因编码区全长678bp,与预期相符;核苷酸序列比对分析显示,猪DUXA和马DUXA基因同源性最高;各物种间DUXA蛋白氨基酸保守性较高;进化树结果显示,猪DUXA基因与骆驼相应序列聚为一支,与山羊、水牛、长江江豚等哺乳动物的遗传距离相对较近;利用在线分析工具对猪DUXA编码蛋白的理化性质进行预测,结果显示猪DUXA的化学分子式C1082H1732N344O354S7,相对分子质量为25448.17,理论等电点为9.4;猪DUXA二级结构预测包含11个α-螺旋、3个β-折叠、19个T-转角和20个无规则卷曲,具有2个HOX结构域,预测其为细胞膜外蛋白,其三级结构和黄牛、山羊、人相似。构建的pCDNA3.1-EGF-DUXA质粒载体长度为6797bp,转染结果显示构建的过表达载体可以在293T细胞中表达。结果表明,本试验成功克隆了猪DUXA基因,并成功构建了过表达载体pCDNA3.1-EGFP-DUXA。