蜜蜂残翼病毒中国DWV-JL1株衣壳蛋白基因序列分析

蜜蜂残翼病毒是引起蜜蜂残翼病的病原体。吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心将成功分离鉴定得到的中国首株蜜蜂残翼病毒毒株命名为“中国DWV—JL1株”，全长9826nt。本文主要研究中国DWV—JL1株核苷酸序列位置为2880～3792nt之间的片段，该段序列为编码衣壳蛋白的一部分，为相对保守序列。通过RT—PCR、克隆及质粒双酶切鉴定分析，得到一段大小约900bp的片段。通过BLAST、进化树及残基化分析，有96％-97％的同源性。氨基酸序列差异性仅为7％。该段序列与韩国株的亲缘关系最近，而与欧洲和美洲各国家获得的毒株序列亲缘关系较远，推测中国DWV—JL1株起源于亚洲。

锦州地区一例蜜蜂残翼病的RT-PCR诊断与蜜蜂残翼病毒的鉴定及同源性分析

为确诊锦州某蜂场蜜蜂大量死亡病因,本试验采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,收集病死蜜蜂提取总RNA,进行反转录,获得c DNA。然后,以c DNA为模板,利用检测常见蜜蜂病毒的引物进行PCR扩增。结果表明,从蜜蜂病料中扩增出编码蜜蜂残翅病毒Helicase蛋白酶的基因片段,大小约702 bp,将分离毒株命名为DWV-JZ。测序结果通过BLAST比对以及与Gen Bank中获得的7个序列进行遗传进化分析,证实DWV-JZ与Gen Bank中的DWV-JL1(KP096414.1)同源性达到95%,亲缘关系最近。

瓦螨(Varroa destructor)寄生密度与蜜蜂卷翅病毒动态复制相关性研究

病毒复制动态变化对揭示病毒病致病的机理具有重要意义。本研究以蜜蜂卷翅病毒(deformed wing virus,简写为DWV)为模型,使用荧光反转录定量PCR方法检测DWV病毒隐性感染蜂群在体壁寄生螨侵袭压力下工蜂体内病毒基因表达量的变化动态,以揭示外界生物压力与隐性感染蜜蜂体内病毒动态复制的相关性。结果显示:弱群势蜜蜂体内DWV基因表达量与引入瓦螨密度呈显著正相关(第3天:R2=0.82;第7天:R2=0.99;双向方差分析F=5.059,P=0.0171);在瓦螨密度增至30%,处理后第7天时DWV浓度达最大值;强群势的蜜蜂群体引入瓦螨后,蜜蜂体内DWV基因表达量在处理后第3天表现出与弱群相似的变化规律(R2=0.88;双向方差分析F=11.74,P=0.001 3),但在处理后第7天时,供试蜜蜂体内DWV浓度整体下降,且不同瓦螨处理水平试验组间的DWV浓度差异不明显(R2=0.66)。结果显示,强群势蜂群的工蜂可有效抑制病毒拷贝量的持续增长,从而表现较强抗病性,而弱群势蜜蜂因病毒动态复制的不可逆激增而导致病毒病暴发。该研究结果在一定程度上解释了弱群势蜜蜂高病毒病易感性和年周损失的原因。

蜜蜂残翼病毒RT-PCR检测及衣壳蛋白VP1基因的序列分析

为了研究蜜蜂残翼病毒(DWV)的遗传变异特点,试验从吉林某地蜂场疑似蜜蜂残翼病的病蜂中初步分离得到1株DWV毒株,采用RT-PCR技术扩增VP1基因并对其进行检验分析。结果表明:基因测序结果与Gen Bank中的DWV毒株衣壳蛋白VP1基因序列同源性为99%左右;将此分离毒株DWV的VP1基因核苷酸序列与Gen Bank中的10个序列进行系统遗传进化树分析,证实其与AB070959.1、NC_005876.1的同源性最近,而与HM067437.1、KJ437447.1的同源性最低。

蜜蜂残翅病研究进展

蜜蜂残翅病病毒(Deformed Wing Virus,DWV)是蜜蜂残翅病的病原体,能够侵染各个发育阶段的蜜蜂,严重时导致蜂蛹发育缓慢,成蜂翅膀畸形、体型萎缩、行动乏力,蜂群早衰;不严重的隐形感染也会缩短蜜蜂寿命。DWV借助于狄斯瓦螨Varroa destructor在全球广泛传播,并产生DWV-B和DWV-C等变异体,它们的共同作用促使蜂群群势急剧衰弱,是导致“越冬蜂群的消失(OCL)”和“蜂群崩溃失调症(CCD)”的主要病因之一,给养蜂业造成巨大损失,而目前尚没有特异性的有效治疗药物。DWV的自身特征、与狄斯瓦螨的关系、以及单独或者和狄斯瓦螨共同作用对蜜蜂的影响等研究都是开发防治技术方法的基础,本文从生物学、流行学、病理学和防治技术等方面对残翅病病毒的最新研究成果进行了综述。

蜜蜂残翼病毒VP2基因密码子优化、原核表达及免疫原性分析

蜜蜂残翼病毒(Deformed wing virus,DWV)是引发世界各地大范围蜂群损失的主要嫌疑对象,间接给农业生产带来了巨大的经济损失。为了探究DWV结构蛋白VP2的免疫原性,深入研究该蛋白的功能和为制备DWV单克隆抗体提供可靠的免疫原,本研究从DWV分离株(GenBank登录号:MF770715)扩增得到VP2基因,同时根据大肠杆菌密码子的偏嗜性对VP2基因进行优化并合成,分别将优化前和优化后的VP2基因克隆到pET-28a载体上,获得重组质粒pET-28a-VP2和pET-28a-opti-VP2,分别转化至宿主菌BL21(DE3)中诱导表达,经SDS-PAGE和Western Blot检测,显示仅优化后的opti-VP2基因高效表达,然后对最佳表达条件进行摸索。在此基础上,对重组蛋白纯化后分3次免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠,同时设置纯化病毒组和空白对照组,对免疫小鼠的抗体水平和淋巴细胞增殖指数(SI)以及干扰素(IFN-γ)、白介素IL-2和IL-4水平进行检测。结果表明,重组VP2蛋白能够诱导产生特异性抗体,促进淋巴细胞增殖,提高IFN-γ、IL-2和IL-4水平,具有良好的免疫原性,为深入研究DWV VP2蛋白功能和开发防治DWV的生物制剂提供了帮助。

蜜蜂残翼病毒TaqMan-MGB探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立

蜜蜂残翅病毒(Deform wing virus,DWV)已成为世界上最著名、分布最广、研究最为深入的昆虫病原。虽然DWV以前存在于蜜蜂种群中,但一种新的媒介—外寄生螨Varroa破坏体的到来和全球传播,极大地促进了DWV的流行病学。为了建立快速、准确且能定量分析的蜜蜂残翅病毒,DWV检测方法,本研究参照GenBank中已登录的DWV高度保守的3C-RdRp基因区域,设计了1对特异性引物和带有羧基荧光素(Fast Auxiliary Memory,FAM)与淬灭基团(Eclipse)标记的TaqMan探针,并对反应条件进行优化,建立了检测DWV的TaqMan-MGB探针荧光定量RT-PCR检测方法(TaqMan qRT-PCR),同时对该检测方法的特异性、敏感性、重复性进行了试验,并对临床样品进行检测。结果显示:该方法最佳上下游引物和探针浓度分别为12.5μmol/L和10μmol/L,最佳退火温度为59℃;敏感性试验中,对DWV质粒标准品检测下限为2.58×10^(1)拷贝/μL;本方法特异性较好,对蜜蜂常见病毒—蜜蜂慢性麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,CBPV)、蜜蜂急性麻痹病毒(Acute paralysis virus,ABPV)、黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)、囊状幼虫病毒(Sacbrood virus,SBV)、以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus,IAPV)和中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)无交叉反应;且批内变异系数和批间变异系数均小于2%。利用该方法对49份临床疑似样本进行检测,其中DWV阳性样本为35份,检出率高于常规RTPCR方法,且病毒载量大于1×10^(7)拷贝/只样本数共24份,表明辽宁和河北部分地区感染DWV蜂群中病毒载量较高,流行情况比较严重。因此,本研究建立的TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,能够用于DWV病原监测、流行病学调查和病毒定量分析等相关研究。