DZNep抗肿瘤作用机制的研究进展

3-去氮腺嘌呤A(3-deazaneplanocin A,DZNep)具有特异性抗肿瘤活性的S-腺苷高半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocysteine hydrolase,SAHH)抑制剂,通过增加S-腺苷高半胱氨酸(SAHS-adenosylhomocysteine,SAH)间接抑制EZH2,DZNep通过抑制果蝇zeste基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)蛋白及靶向多种肿瘤作用机制,从而发挥抗肿瘤作用。大量实验表明,DZNep通过抑制肿瘤细胞恶性增殖、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、抑制转化与侵袭、抑制肿瘤EMT、化疗增敏及逆转放化疗肿瘤耐受性及调节肿瘤免疫微环境等途径抑制多种恶性肿瘤细胞生长。该文梳理并综述已报道的关于DZNep抗肿瘤的作用机制及临床前景应用,为DZNep抗肿瘤作用机制深入研究及抗肿瘤新药研发提供相应参考。

DZNep通过下调EZH2蛋白表达抑制人前列腺癌PC3细胞增殖

目的研究EZH2蛋白抑制剂DZNep对前列腺癌PC3细胞增殖的影响及其用于人前列腺癌治疗的潜在价值。方法 MTT分析DZNep处理、siRNA敲低EZH2和EZH2过表达对PC3细胞增殖的影响,Western blot检测EZH2和Bax/Bcl-2的表达。结果 DZNep抑制PC-3细胞增殖、诱导细胞凋亡,上调Bax基因表达并下调Bcl-2基因表达。敲低EZH2抑制PC3细胞增殖,过表达EZH2则拮抗DZNep对PC3细胞的增殖抑制。结论 DZNep通过下调EZH2表达、诱导细胞凋亡发生从而抑制PC3细胞增殖。DZNep具有抗人前列腺癌治疗的潜在应用前景。

DZNep对Eca109细胞增殖、凋亡及迁移能力的影响

目的:探讨DZNep处理食管鳞状细胞癌Eca109细胞后对其增殖、凋亡及迁移能力的影响。方法:DZNep处理Eca109细胞48 h,以DMSO处理48 h的Eca109细胞作为对照。采用EdU荧光显微镜法检测细胞增殖率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Transwell小室检测细胞迁移数。结果:DZNep处理后的Eca109细胞增殖率为(34.60±4.45)%,低于对照组的(42.37±4.64)%(t=3.625,P=0.002);其细胞凋亡率为(16.27±3.70)%,高于对照组的(7.38±0.77)%(t=7.061,P<0.001);迁移到下室的细胞数为(179±38)个,较对照组的(494±99)个少(t=8.912,P<0.001)。结论:DZNep能够抑制Eca109细胞的增殖和迁移,促进其凋亡。

组蛋白甲基化抑制剂DZNep对小鼠缺血再灌注损伤肾脏的保护作用

目的:探讨组蛋白甲基化抑制剂DZNep在小鼠肾脏缺血再灌注损伤模型中对肾脏的早期保护作用。方法:18只C57BL/6小鼠随机分成假手术组(sham组)、缺血再灌注损伤组(IR组)和缺血再灌注+治疗组(IR+DZNep组)。后两组建立缺血再灌注损伤模型,IR+DZNep组双侧腹股沟皮下注射DZNep(1mg/kg)100μL。假手术组游离双侧肾蒂但不阻断。术后36h采集标本,评价肾功能和肾组织病理学损伤;通过脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测肾小管上皮细胞凋亡情况;通过检测髓过氧化物酶(MPO)评价炎症细胞的浸润程度;采用实时定量反转录聚合酶链式反应(qRTPCR)检测肾脏组织相关炎症细胞因子水平。结果:肾脏缺血再灌注损伤后36h,与IR组相连,IR+DZNep组小鼠血肌酐和尿素氮水平明显下降(69.17±3.49 vs 103.83±14.62,9.56±1.07 vs 0.75±15.83;P<0.05);病理损伤减轻,肾小管细胞凋亡减少,炎症细胞因子水平降低(P<0.05)。结论:DZNep可以通过抑制细胞凋亡、减轻炎症反应等方式降低小鼠缺血再灌注损伤肾脏的损伤程度,发挥对肾脏的保护作用。

EZH2抑制剂DZNep对NK/T淋巴瘤细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

目的探讨果蝇Zeste基因增强子人类同源物2(EZH2)抑制剂DZNep(3-deazaneplanocin)对人NK/T淋巴瘤细胞株SNK-6细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法不同浓度DZNep作用SNK-6细胞后,用CCK-8法测细胞增殖抑制率,用PI染色流式细胞术测细胞周期,用AnnexinV/PI双染流式细胞术测细胞凋亡率;用Westernblot检测Cleaved Caspase-3、CleavedPARP以及EZH2蛋白表达量。结果DZNep能下调EZH2蛋白水平,抑制SNK-6细胞的增殖,诱导G1/S期阻滞,诱导细胞凋亡,并促进Cleaved Caspase-3及CleavedPARP的表达增加。结论DZNep能在体外抑制SNK-6细胞的增殖、诱导G1/S期阻滞及细胞凋亡。

DZNep对裸鼠食管鳞癌移植瘤生长的抑制作用

目的:探讨EZH2抑制剂DZNep对裸鼠Eca109细胞移植瘤生长及mTOR/p70S6K信号通路的影响。方法:将Eca109细胞接种于15只裸鼠右侧背部皮下构建裸鼠移植瘤模型后分为3组,每组5只,其中2组分别腹腔注射5-氟尿嘧啶(5-FU)、DZNep治疗2周,另外1组腹腔注射生理盐水作为对照组。观察肿瘤生长情况,采用Western blot检测肿瘤组织中EZH2、SAHH、组蛋白甲基化相关蛋白及mTOR/p70S6K信号通路相关蛋白、Caspase-3、E-cadherin的表达情况,并通过TUNEL法检测肿瘤组织中细胞的凋亡,计算细胞凋亡率。结果:DZNep组肿瘤块质量小于对照组(P<0.05)。与对照组比较,DZNep组肿瘤组织中Caspase-3和E-cadherin表达水平增高,细胞凋亡率升高(P<0.05)。另外,与对照组相比,DZNep组H3K27me3表达降低,PTEN表达升高,mTOR和p-p70S6K表达均下降(P<0.05)。结论:DZNep可抑制食管鳞癌移植瘤增长,并诱导肿瘤细胞凋亡;其机制可能是通过对EZH2的抑制增强PTEN的表达,从而抑制mTOR/p70S6K信号通路的激活。

DZNep调控乳腺癌外泌体在肿瘤微环境中的作用

背景与目的:乳腺癌是全球女性发病率最高的恶性肿瘤,患者预后差。肿瘤源性外泌体会改变肿瘤微环境并参与调控肿瘤的发生、发展及转移,这将为肿瘤的诊断和治疗提供新的思路。DZNep能够靶向调控H3K27me3组蛋白甲基转移酶的降解,并特异性地诱导肿瘤细胞凋亡,从而抑制多种肿瘤细胞增殖和迁移。本研究旨在探索DZNep对乳腺癌源性外泌体的影响,并观察其通过调节细胞间连接从而改变乳腺癌细胞上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的作用。方法:应用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库和在线分析软件GEPIA2分析EZH2在乳腺癌中的表达,使用肿瘤免疫估计资源(Tumor Immunity Estimation Resources,TIMER)分析EZH2与肿瘤微环境中细胞因子及EMT相关蛋白表达的关系。采用DZNep干预乳腺癌MDA-MB-231细胞,采用差速超速离心法提取外泌体,采用蛋白质印迹法(Western blot)检测CD9、CD63和TSG101的表达情况并鉴定外泌体膜结合蛋白的表达,采用纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)技术对外泌体的布朗运动进行追踪和分析并结合Stokes-Einstein方程式计算出外泌体颗粒的流体力学直径和浓度,采用透射电镜分析外泌体的大小、形态等,以此来探究DZNep对乳腺癌源性外泌体的改变。利用Western blot分别检测EZH2,细胞间连接蛋白如闭合蛋白(occludin)、闭锁小带蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)、层粘连蛋白(laminin)、水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)、连接子蛋白43(connexin 43)、claudin 5和Ⅵ型胶原蛋白(collagenⅥ),EMT相关蛋白E-cadherin和vimentin的表达情况,分析DZNep对肿瘤微环境的调节机制。结果:EZH2在癌组织中的表达高于癌旁组织,EZH2高表达与Luminal A型乳腺癌免疫细胞和基质细胞上调均呈正相关,与乳腺癌E-cadherin、N-cadherin、vimentin表达呈正相关,与BRCA-Luminal B型E-cadherin表达呈正相关、N-cadherin表达呈负相关,与BRCA-Luminal A型N-cadherin、vimentin表达呈正相关(P<0.05)。CD9、CD63、TSG101的表达表明成功提取了MDA-MB-231细胞的外泌体,经DZNep干预后,外泌体粒径明显减小且数量下降,细胞连接蛋白occludin、ZO-1、laminin、AQP4及connexin 43表达降低,collagenⅥ、封闭蛋白5(claudin 5,CLDN5)表达增加;EMT相关蛋白E-cadherin表达增加,vimentin表达降低。结论:DZNep通过抑制EZH2减少乳腺癌细胞中的外泌体生成,进一步改变肿瘤细胞微环境,从而影响EMT现象。

DZNep对口腔鳞癌细胞系Tca8113和SCC15增殖、侵袭和迁移的抑制作用

目的:本研究旨在检测DZNep对口腔鳞癌细胞系Tca8113和SCC15增殖性、侵袭性和迁移性的抑制作用。方法:通过MTT实验检测DZNep对口腔鳞癌细胞系Tca8113和SCC15增殖性的抑制作用并确定药物最适浓度;通过Transwell侵袭实验检测DZNep对口腔鳞癌细胞系Tca8113和SCC15侵袭性的抑制作用;通过Transwell迁移实验检测DZNep对口腔鳞癌细胞系Tca8113和SCC15迁移性的抑制作用。结果:与对照组比较,DZNep组的口腔鳞癌细胞系Tca8113和SCC15增殖活性明显降低(P<0.05),其半抑制浓度(IC50)为1000 nmol·L^-1;DZNep组的口腔鳞癌细胞系Tca8113和SCC15的细胞侵袭和迁移比例也明显降低(P<0.01)。结论:DZNep能有效抑制口腔鳞癌细胞系Tca8113和SCC15的增殖、侵袭和迁移,有望成为口腔鳞状细胞癌靶点治疗的新药物。

DzNep抑制胃癌BGC-823细胞增殖和迁移的作用研究

目的观察DzNep通过抑制EZH2减弱胃癌BGC-823细胞增殖和迁移的作用,探讨其相关机制。方法将人胃癌BGC-823细胞分为DzNep组和对照组,DzNep的干预剂量分别为1μM、5μM和10μM。Western blot检测EZH2蛋白表达水平,CCK-8、平板克隆形成和划痕实验观察DzNep减弱BGC-823细胞增殖和迁移能力,RT-PCR检测Hif-1αmRNA水平。结果与对照组相比,5μM和10μM的DzNep干预24 h均可减少胃癌BGC-823细胞内EZH2的蛋白水平(P<0.05),因此,后续细胞功能学实验采用5μM的DzNep进行干预。CCK-8实验绘制细胞生长曲线显示,DzNep组BGC-823细胞的存活率在48 h低于对照组(P<0.05)。平板克隆形成实验显示,DzNep组集落率少于对照组(P<0.05)。划痕实验于0、20、25和44 h测得DzNep组BGC-823细胞划痕间距相对比值均大于对照组(P均<0.05)。RT-PCR实验显示,1μM的DzNep对Hif-1αmRNA水平无明显影响,5μM的DzNep在24 h能降低Hif-1αmRNA水平(P<0.05)。结论DzNep减弱胃癌BGC-823细胞增殖和迁移的作用可能与抑制EZH2、下调Hif-1α有关。

DZNep诱导HL-60细胞凋亡和生长抑制

[目的]研究S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂DZNep(3-Deazaneplanocin A)对人早幼粒白血病细胞HL-60增殖的影响。[方法]细胞计数法分析DZNep(10~500 nmol/L)处理对HL-60细胞增殖的影响;以DNA片段化、Annexin-V/PI法和线粒体膜电位法检测DZNep处理对HL-60细胞凋亡的影响。Western Blot检测细胞凋亡相关基因Bax和细胞色素C的表达。[结果]50 nmol/L DZNep对HL-60细胞的24、48、72h增殖抑制率达18%、44.5%、81.7%。Annexin-V/PI法显示DZNep能诱导HL-60细胞发生剂量依赖性的细胞凋亡。进一步研究发现,DZNep(50nmol/L)处理24 h诱导23.8%的HL-60细胞发生线粒体途径介导的细胞凋亡,表现为细胞DNA片段化、线粒体膜电位下降和Bax基因表达上调,同时伴有细胞浆内细胞色素C增加。[结论]DZNep能在较低浓度下抑制HL-60细胞增殖并通过激发线粒体凋亡途径诱导HL-60细胞凋亡,具有抗人早幼粒细胞白血病治疗的潜在应用前景。

DZNep通过上调miR-200c表达延缓MGC-803胃癌细胞侵袭和迁移过程

本文旨在研究组蛋白甲基化修饰调控对胃癌细胞mi R-200c的表达调节以及对癌细胞的侵袭和迁移的作用。组蛋白甲基转移酶抑制剂DZNep(2.5μmol/L)处理MGC-803胃癌细胞系,用实时定量PCR(q RT-PCR)检测细胞mi R-200c的表达变化,用Western blot检测上皮间质转化相关蛋白、EZH2、EED、SUZ12、H3K27me3及MMP9的蛋白表达变化,用细胞划痕实验和Transwell法检测细胞迁移和侵袭。结果显示,与对照(DMSO处理)组相比,DZNep(2.5μmol/L)处理的MGC-803肿瘤细胞mi R-200c基因的表达显著提高,ZEB1、ZEB2、N-cadherin的表达显著下调,E-cadherin的表达上调,EZH2、EED、SUZ12、H3K27me3及MMP9的表达均显著降低,细胞迁移、侵袭能力均减弱。以上结果提示,DZNep通过上调mi R-200c的表达延缓胃癌细胞侵袭、迁移过程,其机制涉及对上皮间质转化相关蛋白和PRC2(polycomb repressive complex 2)的表达调节。

DZNep在肿瘤治疗中的研究进展

近年来,果蝇zeste基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)被认为是一种致癌基因,EZH2抑制剂DZNep(3-deazaneplanocin A)因其通过阻断EZH2途径对肿瘤发挥潜在的抗增殖和促凋亡作用而备受关注。DZNep是一个全新的染色质修饰药物,越来越多的证据表明DZNep参与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、转移及新生血管形成等病理生理过程。DZNep可能为肿瘤治疗提供新的途径。本文对近年来DZNep在肿瘤治疗中的研究进展进行综述。

DZNep inhibits the proliferation of colon cancer HCT116 cells by inducing senescence and apoptosis

EZH2 is over-expressed in human colon cancer and is closely associated with tumor proliferation,metastasis and poor prognosis.Targeting and inhibiting EZH2 may be an effective therapeutic strategy for colon cancer.3-Deazaneplanocin A(DZNep),as an EZH2 inhibitor,can suppress cancer cell growth.However,the anti-cancer role of DZNep in colon cancer cells has been rarely studied.In this study,we demonstrate that DZNep can inhibit the growth and survival of colon cancer HCT116 cells by inducing cellular senescence and apoptosis.The study provides a novel view of anti-cancer mechanisms of DZNep in human colon cancer cells.

EZH2广谱抑制剂DZNeP对人牙周膜干细胞成骨分化的影响

目的观察人牙周膜干细胞(hPDLSCs)成骨分化规律,初步探讨EZH2抑制剂DZNeP对hPDLSCs成骨分化的表观遗传调控作用.方法分离和培养hPDLSCs,采用噻唑蓝比色法检测其在不同浓度DZNeP(0、1、2、5、10μmol/L)作用下的增殖情况,碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红染色观察DZNeP对hPDLSCs成骨分化的影响,免疫荧光染色检测DZNeP对hPDLSCs组蛋白H3K27三甲基化的影响.结果与对照组相比,hPDLSCs经1、2、5、10μmol/L的DZNeP作用48 h后,细胞增殖能力明显减弱(均P<0.05),且呈浓度依赖性.ALP染色和茜素红染色结果显示,DZNeP对hPDLSCs成骨早期标志物ALP的表达及成骨晚期矿化结节的形成均具有促进作用.免疫荧光染色结果显示,与对照组相比,DZNeP组hPDLSCs组蛋白H3K27三甲基化荧光强度明显减弱.结论 EZH2抑制剂DZNeP对hPDLSCs增殖有抑制作用,在体外可促进hPDLSCs向成骨方向分化,提示DZNeP可作为治疗牙周炎的潜在小分子药物用于临床转化.

EZH2对HSC-T6细胞增殖活化的影响及其部分机制研究

目的探讨Zeste基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)表达沉默对大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞增殖活化的影响,及其部分调控机制。方法应用EZH2的抑制剂DZNep(3-Deazaneplanocin A)作用于TGF-β1诱导活化的HSC-T6细胞,采用Western blot法检测蛋白EZH2、p-ERK、p-AKT和α-SMA的表达;根据EZH2的碱基序列设计并合成小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA),通过脂质体LipofectamineTM2000转染到HSC-T6细胞内,应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测HSC-T6细胞的增殖变化,Western blot法检测蛋白EZH2、p-ERK、p-AKT和α-SMA的表达。结果将DZNep加入TGF-β1诱导活化的HSC-T6细胞后,EZH2蛋白水平明显降低,同时p-ERK、pAKT和α-SMA蛋白水平亦明显降低;将EZH2-si RNA转染活化的HSC-T6细胞内,HSC-T6细胞的增殖可明显被抑制,同时EZH2、p-ERK、p-AKT和α-SMA蛋白水平亦明显降低。结论抑制EZH2的表达可明显抑制HSC-T6细胞的增殖活化,EZH2可能是潜在的治疗肝纤维化的靶点。

EZH2基因对人食管癌细胞增殖的影响

目的:探讨过表达或沉默果蝇Zeste基因增强子人类同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)基因对食管癌细胞增殖的影响。方法:选用人食管癌细胞株ECA109、TE1、KYSE30、KYSE170作为研究对象,采用实时荧光定量PCR(q PCR)、Western blotting法分别检测食管癌细胞EZH2 m RNA和蛋白的表达水平,然后采用q PCR检测过表达和沉默EZH2基因后对4株食管癌细胞EZH2 m RNA的表达变化;CCK-8增殖实验、克隆形成实验检测过表达和沉默EZH2基因及EZH2抑制剂DZNep(3-deazaneplanocin A)处理对食管癌细胞增殖能力和克隆形成率的影响。结果:食管癌ECA109、TE1细胞中EZH2 m RNA和蛋白水平明显高于KYSE30、KYSE170细胞(P<0.05)。食管癌TE1、ECA109细胞转染EZH2-Sh RNA后EZH2表达水平下调(均P<0.05)、细胞增殖能力降低(1.07±0.08 vs1.59±0.09,P<0.05;0.88±0.08 vs 1.05±0.11,P<0.05)、克隆形成数下调[(200.00±11.43)vs(480.00±13.10)个,P<0.05;(88.00±8.16)vs(220.00±14.69)个,P<0.05]。KYSE30、KYSE170细胞转染EZH2过表达质粒后EZH2表达水平升高(均P<0.05)、细胞增殖能力显著增强(1.06±0.07 vs 0.76±0.06,P<0.05;3.36±0.30 vs 1.50±0.08,P<0.05)、克隆形成数显著升高[(45.00±3.27)vs(18.00±1.63)个,P<0.05;(65.00±4.08)vs(23.00±2.45)个,P<0.05];DZNep处理后,ECA109和TE1细胞增殖能力降低(均P<0.05)、克隆形成数下降(均P<0.05)。结论:EZH2基因能有效促进食管癌细胞的增殖和克隆形成能力,为深入研究EZH2作为食管癌治疗的新靶点提供了实验研究基础。

组蛋白甲基化转移酶EZH1/2在小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化中的作用

目的探讨组蛋白甲基化转移酶EZH1/2在小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化中的表达变化规律及EZH2选择性抑制剂DZNep对EZH1/2在小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化中表达的影响。方法通过体外培养小鼠子宫内膜基质细胞,小鼠子宫内膜基质细胞生长到80%~90%时进行雌孕激素诱导蜕膜化及加抑制剂处理分成以下4组,对照组:2%FBS/DMEM(含P/S);蜕膜化组:加入含有E2(10 nmol/L)+P4(1μmol/L)的2%FBS/DMEM(含P/S);抑制剂(DZNep)组:加入含有DZNep(20μmol/L)的2%FBS/DMEM(含P/S);蜕膜化加抑制剂组:加入含有DZNep(20μmol/L)+E_2+P_4的2%FBS/DMEM(含P/S),0、24、48、72 h拍照,48 h换液,72 h收细胞。利用免疫荧光化学及Real-time PCR方法从蛋白和mRNA水平检测EZH1/2在小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化中的表达。结果 (1)小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化72 h中EZH1/2基因的表达明显上调,蜕膜化组与对照组相比差异有统计学意义(P <0. 05);(2)蜕膜化联合抑制剂组与对照组相比,抑制剂组可以促进EZH1mRNA和EZH2 mRNA的表达,差异有统计学意义(P <0. 05);与蜕膜化组相比,蜕膜化加抑制剂组EZH1 mRNA和EZH2 mRNA的表达上调,差异有统计学意义(P <0. 05);(3) DZNep联合蜕膜化处理抑制EZH2蛋白的表达,但促进EZH1蛋白的表达。结论 (1) EZH1/2基因参与m ESC蜕膜化过程;(2)DZNep单独可以促进小鼠子宫基质细胞蜕膜化;(3)在小鼠子宫内膜蜕膜化细胞中,DZNep在转录水平可以促进EZH1/2 mRNA的表达,在蛋白水平抑制EZH2的表达、促进EZH1的表达。