GST pulldown技术检测HEK293T细胞Daam1的活性

目的:运用GST pulldown技术建立真核细胞中Daam1活性检测的可靠方法。方法:构建GST-RhoA的原核表达载体,并使其在大肠杆菌BL21菌株中大量表达。用GST pulldown和Western blot技术分别检测HEK293T细胞中活化的Daam1及Daam1蛋白的表达。结果:在成功构建了GST-RhoA的原核表达载体,并使其在原核细胞中大量表达融合蛋白GST-RhoA后,用GST pulldown和Western blot技术证实HEK293T细胞中有活化的Daam1和Daam1总蛋白的表达。结论:本工作所建立的GST pulldown技术可以检测HEK293T细胞中Daam1的活性,从而为进一步深入研究Daam1在真核细胞中的功能提供了技术保障。

稳定表达GFP-C-Daam1的MDA-MB-231人乳腺癌细胞系的建立

目的:构建稳定表达GFP和GFP-C-Daam1的MDA-MB-231人乳腺癌细胞系,以便进一步研究Daam1对乳腺癌细胞迁移能力的影响。方法:构建表达GFP和GFP-C-Daam1的慢病毒载体,通过慢病毒感染获取稳定表达目的基因的MDA-MB-231人乳腺癌细胞系。用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞系,Western blot确定重组蛋白表达,并用Boyden chamber小室实验检测细胞运动能力的改变。结果:通过慢病毒感染,建立了稳定表达GFP-C-Daam1的MDA-MB-231人乳腺癌细胞系,该细胞系具备更强的内在运动能力,表明目的基因的表达产物功能正常。结论:用慢病毒载体可以构建稳定表达GFP-C-Daam1的MDA-MB-231人乳腺癌细胞系,从而得到研究活化的Daam1的可靠细胞膜型。

形成素蛋白Daam1与乳腺癌转移的研究进展

形态发生紊乱关联激活因子l(Daam1)是形成素蛋白家族的成员,此蛋白含有1 068个氨基酸,并在人类各组织中广泛表达。Daam1在乳腺癌细胞中异常活化,与乳腺癌的转移、侵袭密切相关,鉴于其在乳腺癌转移过程中的重要作用,或可成为乳腺癌分子靶向治疗的新靶点。

Wnt/PCP信号通路在大鼠缺氧或炎症诱导肺动脉高压形成的作用

目的探讨Wnt/PCP信号通路在大鼠缺氧或炎症诱导肺动脉高压形成过程中的作用机制。方法将40只雄性SD大鼠,分为对照组、低氧组、百合碱组、低氧+百合碱组,测大鼠平均肺动脉压力(MPAP),右心室肥厚指数(RVHI)肺小动脉相应管壁中膜厚度占其管径的百分比(WT%);采用RT-PCR法,从基因水平观察Wnt11、Wnt5a、Dvl-3、DAAM1以及Rho A在缺氧或炎症诱导肺动脉高压形成大鼠肺组织中的表达情况。结果低氧组、百合碱组及低氧+百合碱组大鼠的MPAP与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);3组的RVHI与对照组比较均显著提高(P<0.05),低氧组与百合碱组的RVHI比较差异无统计学意义(P>0.05),低氧组与低氧+百合碱组的RVHI比较无统计学意义(P=0.761);3组的WT%与对照组比较均显著升高(P<0.05)。Wnt11、Wnt5a、Dvl-3、DAAM1、Rho A、mRNA,在低氧组、百合碱组及低氧+百合碱组的表达较对照组均显著下调(P<0.05),而低氧组与百合碱组、低氧组与低氧+百合碱组、百合碱与低氧+百合碱组比较,Wnt5a、Wnt11、Dvl-3、DAAM1、Rho A、mRNA,表达差异均无统计学意义(P>0.05)。结论在缺氧或炎症诱导肺动脉高压形成的过程中Wnt11、Wnt5a、Dvl-3、DAAM1以及RHOA均处于下调,提示Wnt/PCP信号通路在缺氧或炎症诱导肺动脉高压形成的过程中具有一定的作用,但其作用可能受到某种机制的抑制。

DAAM基因家族在胰腺癌中的表达及其与免疫检查点的相关性

目的:探究蓬乱蛋白相关形态形成活化因子(dishevelled-associated activator of morphogenesis,DAAM)1和DAAM2在胰腺癌中的表达及临床意义。方法:购买胰腺癌组织芯片(HPanA120Su02),包含66例癌及54例癌旁样本;采用免疫组织化学法检测DAAM1、DAAM2在胰腺癌及癌旁组织中的表达水平;下载癌症基因组图谱(the Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中DAAM1、DAAM2及细胞程序性死亡配体1(programmed cell death ligand 1,PDL1)等免疫检查点分子的表达谱数据;采用t检验、χ~2检验、log-rank检验、相关性分析等统计学方法分别分析DAAM1、DAAM2在癌与癌旁组织间表达的差异,二者的共表达关系,与临床病理参数、预后的关系,及其与免疫检查点分子表达的相关性。结果:相较于癌旁组织,DAAM1、DAAM2在胰腺癌中的表达均显著上调(P <0.001),且胰腺癌组织中DAAM1与DAAM2的表达呈显著正相关(P <0.001);DAAM1表达水平与肿瘤分化程度(P=0.062)和患者生存状态(P=0.061)存在一定相关性,但差异无统计学意义,与其他临床病理参数无显著相关性(P> 0.05),而DAAM2表达水平与各项临床病理参数均无显著相关性(P> 0.05);TCGA数据库中,DAAM1及DAAM2与PDL1等多个免疫检查点的表达呈显著正相关(P <0.001)。结论:DAAM1、DAAM2在胰腺癌中的表达显著上调,与PDL1等免疫检查点的表达呈正相关,可能是胰腺癌发生、发展及免疫逃避的关键调控因素。

形态发生紊乱关联激活因子l和Fascin在乳腺癌组织中的表达及与临床病理参数和预后的关系研究

目的 探讨乳腺癌组织中形态发生紊乱关联激活因子l (Daam1)和Fascin表达的相关性及其与临床病理参数和预后的关系。方法 选取2019年1月至2021年12月石家庄市第六医院收治的92例乳腺癌患者作为研究对象。通过免疫组织化学法和实时荧光定量PCR法分别检测乳腺癌组织及相应癌旁组织中Daam1和Fascin蛋白及mRNA表达情况,分析Daam1和Fascin蛋白表达与乳腺癌临床病理参数的关系;Kaplan-Meier法分析Daam1和Fascin表达与乳腺癌预后的关系;Daam1和Fascin表达的相关性采用Spearman秩相关或Pearson相关分析。结果 乳腺癌组织中Daam1、Fascin蛋白阳性率及mRNA表达水平均显著高于癌旁正常组织,差异均有统计学意义(P<0.01)。Daam1阳性表达与乳腺癌远处转移显著相关(P<0.05);Fascin阳性表达与乳腺癌组织低分化、雌/孕激素受体阳性、淋巴结转移及远处转移显著相关(P<0.05)。Daam1和Fascin阳性表达组累积无病生存率均显著低于Daam1和Fascin阴性表达组,差异有统计学意义(Log-rankχ^(2)=3.883、5.159;P=0.049、0.023)。乳腺癌组织中Daam1和Fascin蛋白及mRNA表达均明显正相关(r=0.742、0.689,P<0.05)。结论 Daam1和Fascin在乳腺癌组织中呈正相关性高表达,均与患者临床病理特征及预后密切相关,可能共同参与了乳腺癌的发生、发展及转移。