基于HMGB1/RAGE/NF-κB信号通路探讨大黄牡丹汤对急性胰腺炎肠损伤大鼠的干预作用及机制

目的:基于高迁移率族蛋白B1(HMGB1)/晚期糖基化终产物(RAGE)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路探讨大黄牡丹汤对急性胰腺炎肠损伤大鼠的干预作用及机制研究。方法:120只SPF级Wistar大鼠采用5%牛?胆酸钠逆行胰胆管注射制备急性胰腺炎(AP)肠损伤模型。随机分为正常组、模型组、大黄牡丹汤低、中、高剂量组(3.5、7、14 g·kg^(-1)),灌胃给药,奥曲肽组(1×10^(-5)g·kg^(-1)),皮下注射,每组20只,正常组和模型组大鼠给予等体积蒸馏水灌胃,于造模前1 h及造模后每隔12 h给药1次,造模后24 h收集样本。观察大鼠一般情况;生化法检测血清中淀粉酶(AMS)、C反应蛋白(CRP);酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测结肠组织中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)及白细胞介素-6(IL-6)含量;苏木素-伊红(HE)染色观察胰腺和结肠组织病理形态变化;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测结肠组织中HMGB1、RAGE、NF-κB抑制因子激酶(IKK)、核转录因子-κB抑制蛋白α(IκBα)、NF-κB mRNA及蛋白表达水平。结果:观察大鼠一般情况显示,与正常组比较,模型组大鼠出现一般生存状态不佳、扭体反应、大便次数减少及便质干等情况的改变;与模型组比较,各治疗组大鼠上述症状改善;与大黄牡丹汤低剂量组比较,大黄牡丹汤高剂量组症状改善最为明显。生化法检测血清AMS、CRP含量显示,与正常组比较,模型组大鼠AMS、CRP含量明显升高(P<0.05);与模型组比较,大黄牡丹汤组大鼠AMS、CRP含量降低(P<0.05);与大黄牡丹汤低剂量组比较,大黄牡丹汤高剂量组大鼠AMS、CRP含量明显降低(P<0.05)。ELISA检测结肠组织中TNF-α、IL-1β和IL-6含量显示,与正常组比较,模型组大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6含量明显升高(P<0.05);与模型组比较,大黄牡丹汤组大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6含量明显降低(P<0.05);与大黄牡丹汤低剂量组比较,大黄牡丹汤高剂量组和奥曲肽组大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6含量明显降低(P<0.05)。HE染色结果显示,与正常组比较,模型组大鼠出现胰腺、结肠组织坏死、充血、结构不完整;与模型组比较,各治疗组大鼠的胰腺、结肠组织水肿、坏死程度明显改善;与大黄牡丹汤低剂量组比较,大黄牡丹汤高剂量组改善最为明显。Real-time PCR结果显示,与正常组比较,模型组大鼠HMGB1、RAGE、IKK、IκBα、NF-κBmRNA表达明显升高(P<0.05);与模型组比较,大黄牡丹汤各剂量组大鼠HMGB1、RAGE、IKK、IκBαmRNA表达水平明显降低(P<0.05);与大黄牡丹汤低剂量组比较,大黄牡丹汤中、高剂量组合奥曲肽组大鼠HMGB1、RAGE、IKK、IκBα、NF-κB mRNA表达水平降低,其中以大黄牡丹汤高剂量组表现最为明显(P<0.05)。Western blot结果与Real-time PCR分析结果趋势一致。结论:大黄牡丹汤对急性胰腺炎模型大鼠的一般情况、炎症指标及胰腺和结肠组织病理状态有较好的改善作用,其作用机制可能与抑制HMGB1/RAGE/NF-κB信号通路,减轻急性胰腺炎大鼠结肠组织细胞炎症反应有关。

基于网络药理学和实验验证探讨大黄牡丹汤改善大肠湿热型急性胰腺炎大鼠胰腺损伤的机制

目的:揭示大黄牡丹汤对大肠湿热型急性胰腺炎大鼠胰腺损伤的干预作用,并结合网络药理学探讨其可能机制。方法:随机将96只SPF级Wistar大鼠分为6组,空白组、模型组、大黄牡丹汤低、中、高剂量组(3.5、7、14 g·kg^(-1))、清胰利胆颗粒组(3 g·kg^(-1))每组16只。除空白组外,其余各组大鼠采用“高温高湿环境+高糖高脂饮食+5%牛磺胆酸钠逆行胰胆管注射法”建立大肠湿热型急性胰腺炎(AP)大鼠模型。空白组、模型组大鼠给予等体积蒸馏水灌胃,治疗组于造模前1 h、造模后12、24 h分别给药,末次给药1 h后采集样本。观察大鼠一般情况;评价大肠湿热型模型;采用生化法检测血清淀粉酶(AMS)、C反应蛋白(CRP)含量情况;苏木素-伊红(HE)染色观察胰腺组织病理形态;采用网络药理学预测大黄牡丹汤干预急性胰腺炎的可能靶点,并采用分子生物学技术验证相关靶点。结果:与空白组比较,模型组大鼠精神萎靡、毛发杂乱且无光泽、粪便软黏、黄而恶臭、肛温升高并伴有弓背扭体反应,血清中AMS、CRP含量明显升高(P<0.05),光镜下可见胰管走形异常、小叶间隙紊乱及炎症细胞浸润,腺泡细胞水肿、充血、坏死等病理改变;与模型组比较,各治疗组大鼠一般生存状况有不同程度改善、扭体反应减轻、粪便软黏、黄而恶臭明显改善,胰腺组织水肿、坏死程度减轻,血清中AMS、CRP含量降低(P<0.05),以大黄牡丹汤高剂量组效果最明显(P<0.05)。网络药理学预测结果表明常春藤皂苷元、β-谷甾醇、槲皮素是与疾病靶点连接最为广泛的活性化合物,而蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)发现蛋白激酶B(Akt)、肿瘤蛋白P53(TP53)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-6(IL-6)、转录激活因子(JUN)、血管内皮生长因子α(VEGFα)、白细胞介素-1β(IL-1β)、血管内皮细胞黏附分子1(VCAM1)是“药物-疾病”中较为关键靶点,京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集发现丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的响应可能是大黄牡丹汤干预急性胰腺炎的核心机制。分子生物学检测表明与空白组比较,模型组小鼠胰腺组织中TNF-α、IL-6、VCAM-1含量明显上升(P<0.05),丝裂原活化蛋白激酶p38(p38 MAPK)、蛋白激酶2(MK2)、人组织抗原R(HUR)基因蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与模型组比较,各治疗组大鼠胰腺组织中TNF-α、IL-6、VCAM-1含量下降(P<0.05),p38 MAPK、MK2、HUR基因蛋白表达水平均降低,以大黄牡丹汤高剂量组效果最明显(P<0.05)。结论:大黄牡丹汤激活并调控p38MAPK/MK2/HUR信号通路进而抑制炎症因子释放,最终改善胰腺损伤。