丹芪化瘀方含药血清对光损伤人视网膜色素上皮细胞保护机制研究

目的:探讨丹芪化瘀方含药血清对LED冷光源致人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)光损伤的防治作用及最佳药物剂量,探寻其可能存在的保护机制。方法:应用健康的SD大鼠制备丹芪化瘀方空白血清和含药血清,将0%(空白血清)及5%、10%、15%、20%含药血清作用于ARPE-19细胞,每组设6个复孔。各组加入相应的药物于细胞恒温培养箱中培养24 h后采用CCK-8检测细胞活力,筛选最佳含药血清浓度进行后续实验。实验设置对照组、空白血清组、低剂量、中剂量、高剂量含药血清组培养,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测细胞中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、内皮素-1(ET-1)mRNA表达;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测一氧化氮合成酶(NOS)、一氧化氮(NO)、血管内皮生长因子(VEGF)含量;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测对照组、空白血清组、高剂量组iNOS的蛋白表达水平。结果:筛选出16%丹芪化瘀方含药血清作为后续实验干预浓度。与对照组比较,空白血清组iNOS、ET-1 mRNA表达及NOS、NO、VEGF含量均升高(P<0.001),eNOS mRNA表达降低(P<0.001);随着含药血清浓度的增加细胞中iNOS、ET-1 mRNA表达及NOS、NO、VEGF含量逐渐降低,eNOS mRNA表达增加(P<0.001),与低、中剂量组相比,高剂量组的iNOS、ET-1 mRNA表达及NOS、NO、VEGF含量显著降低(P<0.001或P<0.01或P<0.05),eNOS mRNA显著升高(P<0.001或P<0.05);空白血清组iNOS蛋白水平明显高于对照组,而16%含药血清的iNOS蛋白水平明显低于空白血清组(P<0.001)。结论:丹芪化瘀方含药血清可能通过抑制iNOS/NO途径减轻细胞损伤,上调eNOS表达,下调ET-1、VEGF的表达,抑制脉络膜新生血管形成并改善血-视网膜屏障功能,从而发挥保护作用。

丹芪化瘀方对光诱导的人视网膜色素上皮细胞氧化应激的影响

目的观察丹芪化瘀方对光诱导的人视网膜色素上皮(RPE)细胞氧化应激的影响,探讨其保护视网膜的作用机制。方法2组大鼠分别以31.05 g/kg丹芪化瘀方中药颗粒水溶液和等体积蒸馏水灌胃,制备含药血清和空白血清。常规培养的RPE细胞使用白色发光二极管(LED)冷光灯于(7,500±200)LUX光照强度的下直落式照射12 h,建立RPE细胞光损伤模型,随机分为模型组(MG)、低剂量丹芪化瘀方组(L-DQHY)、中剂量丹芪化瘀方组(M-DQHY)、高剂量丹芪化瘀方组(H-DQHY),另将采用锡纸遮光的对照细胞设为对照组(CG)。CG组细胞不加任何试剂,MG组细胞加入大鼠空白血清,L-DQHY组、M-DQHY组、HDQHY组细胞分别加入4%、8%、16%浓度的丹芪化瘀方大鼠血清,培养24 h。细胞计数试剂-8(CCK-8)法检测细胞活性,流式细胞仪检测活性氧(ROS)表达,实时荧光定量PCR(RTqPCR)法检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)mRNA表达,酶联免疫吸附法(ELISA)检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)表达水平。结果(1)细胞活性:MG组细胞活性低于CG组(t=13.592,P=0.000),M-DQHY组、H-DQHY组细胞活性高于MG组(tM-DQHY=3.910,P=0.001;tH-DQHY=9.028,P=0.000),差异均有统计学意义。(2)ROS:MG组ROS表达水平高于CG组(t=13.457,P=0.000),L-DQHY组、MDQHY组、H-DQHY组ROS表达水平低于MG组,(tL-DQHY=7.697、tM-DQHY=8.325、tH-DQHY=13.219,均P=0.000),差异均有统计学意义。(3)NOX4 mRNA:MG组NOX4 mRNA表达水平高于CG组(t=42.469,P=0.000),L-DQHY组、M-DQHY组、H-DQHY组NOX4 mRNA表达水平低于MG组(tL-DQHY=17.238、tM-DQHY=28.764、tH-DQHY=35.210,均P=0.000),差异均有统计学意义。(4)SOD、GSH-Px、MDA:MG组MDA表达水平高于CG组(t=50.375,P=0.000),SOD、GSH-Px表达水平低于CG组(tSOD=39.847、tGSH-Px=45.431,均P=0.000);L-DQHY组、M-DQHY组、H-DQHY组MDA表达水平低于MG组(tL-DQHY=13.821、tM-DQHY=20.223、tH-DQHY=40.067,均P=0.000),SOD、GSH-Px表达水平高于MG组(SOD:tL-DQHY=8.913、tM-DQHY=14.019、tH-DQHY=28.395,均P=0.000;GSH-Px:tL-DQHY=7.860、tM-DQHY=20.350、tH-DQHY=34.127,均P=0.000),差异均有统计学意义。结论丹芪化瘀方能下调NOX4/ROS信号通路相关蛋白的表达,减少MDA表达,增加SOD、GSH-Px的表达,起到有效拮抗LED对RPE细胞的氧化损伤作用。