南瓜籽蛋白源血管紧张素转化酶抑制肽的制备及其降血压活性

食源性降血压肽在调节机体血压过程中发挥着一定的积极作用。本实验采用碱性蛋白酶水解南瓜籽蛋白,水解物经膜分离获得血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制肽,通过质谱鉴定其结构,并采用抑制动力学和分子对接方法研究ACE抑制肽的活性机制;此外,通过ACE抑制活性实验、自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHRs)模型等评价南瓜籽蛋白水解物、膜分离组分以及南瓜籽肽的降血压活性。结果表明,低于1 kDa南瓜籽蛋白水解物组分ACE抑制活性较好,1 mg/mL下ACE抑制率为46.22%,100 mg/kg mb剂量下灌胃SHRs 6 h后收缩压可以降低21.42 mm Hg;鉴定出9个ACE抑制肽(LLV、LVF、LTPL、SVLF、LLPQ、MLPL、LLPGF、VLLPE和RFPLL),其中RFPLL、LLPGF、MLPL和LVF具有较好的ACE抑制活性,半抑制浓度均低于1 mmol/L;RFPLL和LVF具有较好的降血压活性,30 mg/kg mb剂量下灌胃6 h后SHRs的收缩压降低量分别为37.0 mm Hg和22.2 mm Hg,SHRs的舒张压降低量分别为17.0 mm Hg和11.2 mm Hg;RFPLL、LLPGF、MLPL和LVF可以很好地对接ACE的活性中心,RFPLL是ACE混合型抑制剂,MLPL对ACE的抑制模式可能是竞争型抑制,LLPGF、LVF可能是ACE的非竞争型抑制剂。综上,低于1 kDa南瓜籽蛋白水解物是一种良好的降血压功能食品原料,其中RFPLL和LVF可用于降血压功能食品或者药品的开发原料。

马铃薯贮藏蛋白Patatin及其突变体分子动力学和分子对接的研究

马铃薯贮藏蛋白Patatin具有水解脂肪的能力,且特定位点的突变能够影响Patatin的水解酶活性.Patatin的水解酶活性中心是由Ser77和Asp215组成,首先采用分子动力学方法研究Patatin及其突变体的稳定性和构象变化,通过结构比对没有发现构象规律性的变化,然后采用分子对接方法,发现了两个基团(Patatin及其突变体活性位点Ser77的羟基与底物p-硝基苯基癸酯的酯键)间的距离具有规律性:即H109A和D182A(活性减弱)两个基团之间的距离偏大,而R368A,E140A,H109N(活性增强)两个基团之间的距离偏小,符合之前的生化数据.这说明Ser77的羟基与底物PNPC10的酯键间的距离可能能够影响底物小分子与Patatin蛋白的结合,从而影响Patatin酯酶的活性.同时,根据细胞内溶质磷脂酶A2(cPLA2)反应过程,我们推测了Patatin与底物之间可能的催化机制.

番茄碱的制备及其对乙酰胆碱酯酶的抑制作用

本实验采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(ultra-performance liquid chromatography-quadrupole timeof-flight mass spectrometry,UPLC-QTOF-MS)和核磁共振(nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR)氢谱、碳谱鉴定从番茄叶中提取并纯化的番茄碱;利用紫外光谱法、分子荧光光谱法和分子对接技术研究番茄碱对乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)活性的影响,同时探究番茄碱与AChE的结合方式,为番茄碱的神经保护机制提供理论依据。结果表明,纯化产物经UPLC-QTOF-MS和^(1)H NMR、^(13)C NMR分析确定为番茄碱。利用紫外光谱法检测出番茄碱可部分抑制AChE的催化活性,并且番茄碱对AChE的抑制作用为竞争性抑制。分子荧光光谱显示,经番茄碱处理的AChE蛋白在340 nm波长处的发射荧光强度下降,并出现红移现象;Autodock分子对接技术分析结果显示,番茄碱与AChE蛋白中的Ser293、Phe295、Phe338、Phe297、Ser125、Gly121、Ser203、Glu202、Gly120、His447、Gly448、Ile451、Trp86、Tyr124、Tyr337、Tyr341、Ile294形成疏水相互作用并与其中的Trp86形成氢键,表明AChE的微环境发生了变化,竞争性地干扰了底物乙酰胆碱与AChE的结合。因此,番茄碱是通过形成氢键和疏水作用的方式抑制AChE活性。

基于虚拟筛选发现4-羟基喹啉类新型IDO1抑制剂

目的采用药效团模型和分子对接方法对ZINC、Chembridge数据库进行虚拟筛选,并通过酶活性测试进行验证,以发现新骨架结构的IDO1抑制剂。方法通过分子对接方法靶向IDO1酶活性位点,对ZINC数据库进行虚拟筛选,得到苗头化合物,进行酶活性测试,发现酶活性较好的先导化合物;随后用已进入临床研究的3个IDO1抑制剂构建药效团模型,以此模型对先导化合物类似物进行虚拟筛选,并测定化合物的抑酶活性;通过分子动力学模拟探究化合物与IDO1的结合模式。结果通过分子对接方法对超过200万个虚拟化合物进行筛选得到11个先导化合物并测酶活性,其中ZINC91657208抑酶活性较好,IC50约为77.15μmol/L,活性骨架为4-羟基喹啉。亚结构检索4-羟基喹啉的结构得到31个类似物,利用药效团虚拟筛选出10个化合物,并测酶活性,其中3个4-羟基喹啉类化合物均具有明显的抑酶活性,而Chembridge29374490为酶活性最好的IDO1抑制剂,其IC50约为37.78μmol/L。经分子动力学模拟平衡后,其骨架原子均方差偏根(root mean square deviation, RMSD)分别为1?和2.4?。结论从ZINC和Chembridge数据库中发现了新型4-羟基喹啉类IDO1抑制剂。

计算机辅助的蛋白质降血压活性评估方法

目的借助虚拟水解与分子对接软件,建立蛋白质降血压活性评估函数。方法采用Autodock软件将胃肠道蛋白酶水解可能产生的二、三肽与血管紧张素I转化酶(angiotensin I-converting enzyme, ACE)迚行分子对接,根据对接能量值对短肽的ACE抑制活性迚行预测,幵对肽的结构特征迚行了详细地分析和统计。基于肽段与ACE结合的能量值建立可评估食品蛋白质降血压活性(G值)的打分函数,幵对22条已知氨基酸序列的可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)蛋白质的降血压活性迚行评估。结果对于二、三肽,由带电荷的氨基酸、芳香族氨基酸和脯氨酸组成的肽段更易与ACE结合,此外,酸性氨基酸(带负电荷)所组成的肽段也易与ACE结合。采用打分函数对22条可口革囊星虫蛋白质的降血压活性迚行评估,其中19条蛋白质具有较好的降血压活性。结论可口革囊星虫是一种良好的降血压肽来源,计算机辅助的基于对接能量值的ACE抑制活性预测以及打分函数建立对生物活性肽的研究具有重要的参考价值。

黑曲霉3.316β-葡萄糖苷酶底物亲和性研究

β-葡萄糖苷酶属于纤维素酶系中的限速酶。为了研究酶解过程中底物与酶的连接方式和找到β-葡萄糖苷酶的最适底物,以来源于黑曲霉3.316(Aspergillus niger 3.316)的β-葡萄糖苷酶为研究对象,通过对3种底物的分子对接了解对接结构,并测定动力学参数进行试验验证。试验结果表明:3种底物与β-葡萄糖苷酶复合物均以氢键相连。在3种过渡态复合物中,纤维二糖与酶的复合物结构最稳定,原因可能是纤维二糖与β-葡萄糖苷酶形成了H-π共轭;动力学参数表明,纤维二糖为底物时的催化速率和最大反应速率最大,而4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl beta-D-glucopyranoside,pNPG)与β-葡萄糖苷酶的亲和力最强。该研究找到了β-葡萄糖苷酶的合适底物,并发现影响催化效率和催化速率的原因可能是H-π共轭,这为β-葡萄糖苷酶的后期分子改造提供了一定的参考价值。

密花香薷体外对代谢综合征相关酶抑制活性研究

目的:探讨密花香薷粗提物体外对酶抑制的作用,初步阐明其对代谢综合征的药效物质基础。方法:体外测定密花香薷粗提物及其不同萃取部位对多种酶活性的抑制率,与阳性对照比较IC50值,高效液相色谱法测定密花香薷中主成分含量。分子对接计算主成分与酶抑制作用相关目标基因的结合能。结果:密花香薷粗提物对α-淀粉酶、黄嘌呤氧化酶、胰脂肪酶、乙酰胆碱酯酶均有一定的抑制作用,IC_(50)值分别为0.199 mg/mL、0.254 mg/mL、0.258mg/mL、0.057 mg/mL。密花香薷乙酸乙酯部分对酶抑制作用最强,其中含量最高为绿原酸57.40 mg/g和槲皮素37.51 mg/g。分子对接发现绿原酸、槲皮素与以上代谢综合征酶抑制作用相关目标基因结合作用良好。结论:密花香薷粗提物对代谢综合征相关多种酶有一定的抑制活性,初步认为密花香薷治疗代谢综合征的药效物质基础可能为绿原酸与槲皮素。

豆粕血管紧张素转化酶抑制肽的结构鉴定及作用机制解析

以大豆粕为原材料,利用超声辅助酶解技术、超滤-?KTA层析相结合的方法分离纯化获取豆粕酶解产物中血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)抑制肽,对其分子质量分布进行研究,后通过质谱分析与分子对接技术鉴定并筛选出ACE抑制活性肽的氨基酸序列,经固相合成肽序列,检测其ACE抑制肽的活性并基于分子对接技术探索其抑制机制。结果表明:经超声辅助酶解提取获得的豆粕肽分子质量主要分布在6 000 Da以下;根据分子对接的最低预测自由能筛选出的GVRP(-8.44 kcal/mol)和IIVTP(-9.04 kcal/mol)可以抑制ACE活性,半抑制浓度(50%inhibitory concentration,IC_(50))分别为(84±0.06)、(77±0.08)μmol/L;分子对接结果表明:GVRP、IIVTP能够与ACE的活性口袋S1、S1′、S2形成氢键相互作用,共有的过近接触(3.5?范围内)ACE氨基酸残基为His513、Ala354和Glu384。本研究基于串联质谱与分子对接技术,建立从混合多肽中快速鉴定、筛选活性多肽的方法,探究活性多肽与ACE稳定结合并体现其ACE活性的抑制机制,为后续的深入研究提供一定参考。

分子对接阐明草甘膦与水稻醛酮还原酶(OsALR2)的作用及OsALR2的表达纯化

草甘膦是一种广谱高效的有机磷类除草剂,因其对水稻等禾本科作物缺乏选择性,导致其在水稻田中的应用受到限制。杂草中醛酮还原酶(aldo-keto reductase,AKR)具有降解小分子农药草甘膦的功能,但是水稻响应草甘膦的作用机制未知。本文通过生物信息学分析、分子对接研究草甘膦与其在水稻中的靶标AKR蛋白OsALR2的互作机制。采用TMHMM 2.0和DiANNA 1.1 web server等在线软件对OsALR2蛋白的跨膜特性和二硫键含量等生物学特性进行了分析,结果表明OsALR2分子量为35 kD,等电点为5.89;OsALR2不是膜蛋白,但是含有3组二硫键。使用AlphaFold预测OsALR2蛋白的三级结构,并利用Auto Dock Vina将草甘膦与OsALR2进行分子对接,结果显示,最低结合能为-13.4 kcal/mol,草甘膦与OsALR2的结合主要通过氢键作用。通过Ramachandran图,ERRAT和Verify 3D证明对接获得的三维结构是合理的。进一步通过分子克隆技术构建重组表达载体pET-32a-OsALR2并进行原核表达,结果显示OsALR2主要以包涵体的形式表达,对包涵体进行变复性后,蛋白表现出酶活性且蛋白结构有较好的均一性。本文的研究结果助于阐明草甘膦与水稻蛋白互作的分子机制,为研发抗草甘膦水稻新品种和新型小分子农药提供理论指导。

基于分子对接对唐古红景天中抑制精氨酸酶活性成分的研究

目的研究唐古红景天中抑制精氨酸酶的活性成分,并明确其酶动力学反应类型。方法以精氨酸酶为把点,利用Autodock Tools软件进行分子对接,结合小分子的对接评分与结合模式分析结果,虚拟筛选出唐古红景天中特异性作用于精氨酸酶的抑制剂。利用尿素显色反应确定唐古红景天中没食子酸对精氨酸酶的IC_(50)、Ki、Ki'值与酶动力学反应类型。结果分子对接结果显示,从唐古红景天11个化学成分中获得同精氨酸酶结合能最低的为没食子酸(结合能为-5.80kcal/mol)。没食子酸对精氨酸酶的IC_(50)为124.30 μM、Ki值为106.70 μM、Ki'值为193.61 μM。结论没食子酸具有抑制精氨酸酶活性的作用,酶动力学反应类型为混合竞争性抑制。

基于虚拟筛选的新型吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂的发现及活性评价

目的应用药效团模型及分子对接的综合虚拟筛选策略,对Specs及Chembridge数据库进行筛选并进行生物学活性评价,以期发现新型吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO1)抑制剂。方法基于已报道IDO1抑制剂,利用Discovery Studio 2019软件的Pharmacophores(Hiphop)模块构建药效团模型。通过最优药效团模型初步筛选了Specs及Chembridge数据库,后采用LibDock及CDOCKER程序靶向IDO1活性位点进行层级分子对接,最终保留了40个苗头化合物,并在100μmol/L浓度下进行了细胞水平IDO1酶抑制活性初筛。选取初筛抑制率大于50%的11个化合物进行细胞水平及生化水平抑酶活性的进一步测定。采用SPR及分子对接模型进一步确证及阐明化合物与IDO1酶之间的相互作用方式。结果发现羟基嘧啶类化合物29在细胞水平及生化水平上均呈现了IDO1酶抑制活性,EC50和IC50分别为(53.93±1.22)μmol/L和(179±8.12)μmol/L。SPR研究进一步确证了化合物29与IDO1之间的直接结合(KD=65.92μmol/L)。分子对接模型研究显示羟基嘧啶基团与IDO1的卟啉环之间存在较为丰富的相互作用,是靶向识别的关键基团。结论羟基嘧啶类化合物29是一类新型IDO1抑制剂,可作为IDO1酶抑制剂的先导物,通过进一步结构改造及优化,有望获得高效、结构新颖的IDO1抑制剂及新型肿瘤免疫治疗药物。

基于计算机辅助药物设计方法探究敦煌消痹止痛酊治疗骨关节炎的物质基础

目的采用皮肤渗透性参数计算、复杂网络分析、分子对接、分子动力学模拟等计算机辅助药物设计结合化学分析、体外生物试验的“干湿”结合策略探究敦煌消痹止痛酊治疗骨关节炎(osteoarthritis,OA)的物质基础。方法选择被实验证实的中药来源的可透皮化合物,利用Schr?dinger软件Qikprop模块进行皮肤渗透性参数计算,建立透皮参数范围标准,并筛选敦煌消痹止痛酊中满足条件的化合物。对敦煌消痹止痛酊进行功效分组,通过靶点反向预测-复杂网络分析-KEGG通路富集分析探讨不同功效组治疗OA的潜在靶点及KEGG通路。采用分子对接的方法对方中符合皮肤渗透性参数范围的成分进行虚拟筛选,挑选化合物进行酶活性测定、ADMET计算、皮肤渗透性测定、细胞试验、外植体试验研究。结果全方得到潜在透皮成分为69个,复杂网络分析结果显示活血组治疗OA的特有靶点主要为VEGFA、IGF1R及HIF-1α等,主要KEGG通路为Ras、RAP1等。清热组治疗OA的特有靶点主要为TLR9、IL-6及ADAMTS5等,主要KEGG通路涉及TNF、NF-κB等信号通路;分子对接-酶活性-细胞试验结果显示,升麻素、欧前胡素和香草酸对COX-2具有抑制活性,可以抑制软骨细胞PGE2的合成。在软骨外植体模型中,升麻素可以有效缓解软骨损伤;体外透皮试验显示,升麻素12 h内皮肤累积渗透量达到128.1μg·cm-2,透皮吸收百分率为28.2%。分子动力学模拟结果显示,升麻素与COX-2的氨基酸残基TYR 355、LEU 384、SER 530形成较为稳定的氢键作用,与PHE 518形成较为稳定的疏水相互作用。结论本研究采用计算机辅助药物设计联合多种化学生物实验技术的“干湿”结合策略初步阐明了敦煌消痹止痛酊治疗OA的物质基础,为外用中药的研究提供参考。

黄酮类化合物对CYP1A1酶抑制活性的3D-定量构效关系研究

目的通过构建3D-定量构效关系(quantitativestructure-activityrelationship,QSAR)模型,研究黄酮类化合物对细胞色素P450酶1A1(cytochrome P450 1A1,CYP1A1)的抑制活性。方法借助Topomer CoMFA方法开展黄酮类化合物结构-CYP1A1抑制活性构效关系研究;通过体外孵育体系对化合物CYP1A1抑制活性进行评价,开展预测模型验证和优化;通过分子对接技术探究黄酮类化合物抑制CYP1A1活性的作用机制。结果构建的3D-QSAR模型交叉验证相关系数(q2)为0.800,非交互验证系数(r^(2))为0.9650,外部验证的相关系数(rpred^(2))为0.9567,表现出良好的稳定性和预测能力。利用该模型预测9种黄酮类化合物的CYP1A1抑制活性,实验值与预测值的相关系数r^(2)为0.832 8。分子对接结果显示,黄酮类化合物能与CYP1A1空腔内的THR497、ASN222、ASN255、SER116和ASP313等残基形成氢键,影响该类化合物的CYP1A1抑制活性大小。结论构建的模型具有良好预测能力与稳定性,为设计高活性分子提供理论参考,为新型CYP1A1酶抑制剂的开发提供新的思路。

达托霉素作为新的胰蛋白酶激活剂的初探

首次发现达托霉素是一种新的胰蛋白酶激活剂,当胰蛋白酶与达托霉素的物质的量的比在反应时达到34.05时,达托霉素对胰蛋白酶比活力的激活率平均达到32.92%。通过计算机模拟技术对达托霉素与胰蛋白酶以及达托霉素对胰蛋白酶底物复合物分别进行分子对接,并利用等温滴定量热法(Isothermal titration calorimetry,ITC)验证模拟结果。研究发现达托霉素与胰蛋白酶的活性中心位置很靠近,达托霉素链状中的天冬氨酸的R基与酶活性中心的组氨酸-57发生了氢键相互作用,达托霉素使酶和底物复合物结构更加稳定,从而有利于催化作用。ITC结果表明胰蛋白酶上具有1个达托霉素结合位点,解离常数Kd为17.83μM,摩尔结合焓△H为237.9±28.17 cal/mol,摩尔结合熵△S为22.5 cal/mol·deg,这些结果从热力学角度支持了分子对接结果。研究发现达托霉素除具有抗革兰氏阳性耐药性细菌的功能外,还能促进胰蛋白酶比活这一新的功能,是一种新的胰蛋白酶激活剂。