仔猪外周血中内参基因的筛选及细胞因子和受体的表达水平

【目的】中国地方猪种在抗病性和免疫力方面优于国外猪种,但是对中外猪种抗病力差异的遗传基础和免疫机理却了解甚少。有推测不同品种猪对疾病的抵抗力不同可能在细胞因子和受体的表达水平上有所反映。本研究以抗病力强的大蒲莲和抗病力相对较弱的长白猪的断奶仔猪为研究对象,对6个具有重要功能的细胞因子(促炎症细胞因子(IL8和TNFα),抗炎症细胞因子(IL10),干扰素调节因子(IRF3)和干扰素(IFNA和IFNG))和1个最具代表性的模式识别受体(TLR4)基因在大蒲莲和长白仔猪群体外周血液中的基因表达量进行检测,并对各基因进行品种和母猪效应分析,为了解中外不同猪种的免疫水平奠定基础。【方法】采集大蒲莲(104头)和长白(171头)35日龄仔猪的外周血,提取总RNA,逆转录为c DNA后,利用荧光定量PCR法,首先对6个常用的候选内参基因(ACTB、GAPDH、B2M、TBP、RPL4和PPIA)利用ge Norm软件进行稳定性评价分析,筛选仔猪外周血RNA基因定量分析中稳定表达的内参基因,然后利用该内参基因进行校正,对上述细胞因子和模式识别受体基因在大蒲莲和长白仔猪群体外周血中的表达量进行定量,并利用最小二乘法对细胞因子和受体在大蒲莲和长白仔猪群体中的表达量进行品种和母猪效应分析。【结果】研究结果归纳为4个方面:1.外周血样品中内参基因稳定性值M从大到小依次为:ACTB(0.595)>GAPDH(0.571)>PPIA(0.469)>RPL4(0.466)>TBP(0.461)>B2M(0.440),选择表达稳定性最高的基因B2M作为内参基因对细胞因子和受体基因的表达量进行校正。2.检测的6个细胞因子的基因表达量存在很大的差异,各细胞因子基因表达量ΔCt最大值和最小值之间差值分别为9.23—14.25和5.83—8.73;受体TLR4的ΔCt值的最大和最小值之间相差相对较小,大蒲莲和长白仔猪分别为5.03和3.82。3.大蒲莲和长白两品种间相比较,细胞因子在长白猪群体中的表达量平均值均高于大蒲莲群体,而受体TLR4的基因表达量在长白猪群体中的表达量低于大蒲莲群体;而且,大蒲莲群体内个体间细胞因子和受体表达量变异系数(平均31.43%)要大于长白群体(平均19.10%),这与大蒲莲选育程度低,群体内个体间的差异程度要大相一致。4.品种效应分析表明除IL10外,其他6个目的基因的ΔCt值品种间差异达显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)水平。母猪效应分析表明母猪对各细胞因子和受体的影响均达到了极显著水平(P<0.01)。【结论】成功筛选了外周血基因表达分析中稳定表达的内参基因(B2M),对常规饲养管理下大蒲莲和长白仔猪外周血中的主要细胞因子和受体基因的表达进行群体水平分析。本研究结果为了解中外不同猪种的种质特性和抗病品种的选育提供了基础数据。

品种和母猪对仔猪血常规和T淋巴细胞亚群性状的效应分析

本研究以抗病力强的华北型黑猪大蒲莲猪和抗病力相对较弱的引进猪种长白猪的断奶仔猪为研究对象,利用全自动血液细胞分析仪和流式细胞仪测定了大蒲莲(124头)和长白(187头)仔猪血液的血常规和T淋巴细胞亚群性状,并对这些性状进行了品种和母猪效应分析。结果表明:大多数血常规性状的变化范围较小(平均22.92%),成熟T淋巴细胞各性状的变异系数(平均44.5%)小于非成熟T淋巴细胞各性状的变异系数(平均112.77%)。大蒲莲和长白2个品种间比较,除RBC、HGB、LY、MID和PLT外,其他14个血常规性状的差异均达到极显著(P<0.01)水平;而对于T淋巴细胞亚群性状,除CD4+CD8-CD3-、CD4+CD8+CD3-和CD3+外,其他7个性状的差异均达到显著(P<0.05)或极显著水平(P<0.01)。本研究中的124头大蒲莲仔猪和187头长白仔猪分别来自13窝大蒲莲母猪和28窝长白母猪,母猪窝效应对血常规各性状均具有显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)的影响。本研究大规模测定了大蒲莲猪和长白猪的仔猪血常规和T淋巴细胞亚群各指标,为了解中外不同猪种的差异,挖掘我国地方猪的种质特性奠定基础。

大蒲莲猪不同发育阶段组织RT-qPCR分析中适宜内参基因筛选

利用适宜数量且表达稳定的内参基因对目的基因的表达量进行标准化是获得准确、可靠RT-qPCR数据的重要条件。以不同日龄大蒲莲猪8种组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠组织、肌肉、血液)为试验材料,使用ge Norm、Norm Find软件对8个常用候选内参基因(ACTB、B2M、GAPDH、RPL4、SDHA、TBP、YWHAZ、PPIA)的表达稳定性进行分析,筛选适宜内参基因及其组合。ge Norm、Norm Find软件联合分析结果表明,不同日龄大蒲莲猪心脏中表达最稳定的内参基因为TBP、PPIA和YWHAZ,肝脏、肾脏、肠组织和肌肉中最稳定的内参基因均为TBP和PPIA,脾脏中表达最稳定内参基因为TBP和RPL4,肺脏中表达最稳定内参基因为TBP、RPL4、PPIA和ACTB,血液中表达最稳定内参基因为ACTB、YWHAZ和GAPDH。由于大蒲莲猪8种体组织中最适宜内参基因组合和数量不同,因此内参基因筛选是进行RT-qPCR数据分析的必要条件。结果可为研究大蒲莲猪目的基因表达时适宜内参基因的选择提供帮助。

杜长蒲和大长蒲猪胴体性能及肉品质比较

研究测定了杜长蒲和大长蒲三元猪的胴体品质和肉质特性。结果表明:大长蒲的眼肌面积较大,瘦肉率较高,分别比杜长蒲猪高21.80%(P>0.05)、8.13%(P>0.05),平均背膘厚大长蒲比杜长蒲低10.89%(P>0.05);肉色、大理石纹评分、a值和a24值都以杜长蒲较高,分别比大长蒲猪高10.34%(P>0.05)、14.40%(P>0.05)、12.08%(P>0.05)和7.39%(P>0.05);滴水损失以大长蒲较低,比杜长蒲低15.87%(P>0.05);肌内脂肪含量杜长蒲比大长蒲高10.08%(P>0.05)。背最长肌甘氨酸含量以杜长蒲猪较高,比大长蒲猪高8.11%(P<0.01)。背最长肌脂肪酸含量品种间差异不显著。

大蒲莲猪、长蒲及杜长蒲猪胴体性能和肉品质比较

研究测定了大蒲莲猪、长蒲二元猪及杜长蒲三元猪的胴体品质和肉质特性。结果表明,大蒲莲猪眼肌面积最小,分别比长蒲猪和杜长蒲猪低36.45%(P<0.01)、31.04%(P<0.05);后腿比例杜长蒲比大蒲莲猪高8.89%(P<0.05);皮率以大蒲莲猪最高,分别比杜长蒲及长蒲高88.36%(P<0.01)和54.63%(P<0.01);瘦肉率以杜长蒲最高,分别比长蒲和大蒲莲猪高2.75%(P>0.05)和16.19%(P<0.05)。大蒲莲猪肉色评分比长蒲二元猪高14.29%(P<0.05);肌内脂肪含量以大蒲莲猪最高,分别比杜长蒲和长蒲高106.67%(P<0.01)和103.76%(P<0.01)。背最长肌胱氨酸含量以大蒲莲猪最高,分别比杜长蒲和长蒲猪高7.14%(P<0.05)和8.25%(P<0.01);蛋氨酸含量长蒲猪比大蒲莲猪高10.65%(P<0.05)。背最长肌硬脂酸以杜长蒲猪最高,其次是长蒲猪,分别比大蒲莲猪高18.43%(P<0.01)、10.88%(P<0.05);油酸以大蒲莲猪含量最高,分别比杜长蒲和长蒲高10.26%(P<0.05)和7.03%(P>0.05)。

杜洛克×(大约克×大蒲莲猪)杂种猪肥育性能及胴体肉品质研究

研究测定了杜大蒲猪的生长肥育性能、胴体品质和肉质特性。结果表明，杜大蒲猪生长速度较快，饲料报酬较高，30-100 kg平均日增重为725.23 g，料重比2.88。杜大蒲猪的屠宰率、眼肌面积和瘦肉率较高，分别为74.70%、43.38 cm2、64.53%。杜大蒲猪肉色、大理石纹评分和肌内脂肪含量分别为3.63、3.00、2.49%。每100 g背最长肌氨基酸总量、鲜味氨基酸含量和必需氨基酸含量分别为19.36、15.34、7.62 g；鲜味氨基酸占总氨基酸的比例和必需氨基酸占总氨基酸的比例分别为79.22%和39.36%。棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸含量分别为24.43%、11.59%、42.84%和9.85%。

TNFRSF1A基因CpG岛甲基化与基因表达及T淋巴细胞亚群指标的相关性分析

旨在探讨TNFRSF1A基因CpG岛的甲基化水平,阐明该基因甲基化与基因表达及T淋巴细胞亚群性状的关系。本研究以抗病力强的华北型黑猪大蒲莲猪和抗病力相对较弱的引进猪种长白猪的仔猪为试验群体,通过亚硫酸氢盐处理后测序法(BSP)探求TNFRSF1A基因上游CpG岛甲基化情况,并将甲基化位点的甲基化频率与基因表达量及T淋巴细胞亚群性状进行相关性分析。结果表明:1)TNFRSF1A基因起始位点附近预测到2个CpG岛(Island),跨这2个CpG岛进行BSP测序后共发现25个CpG位点,其中Island 1和Island 2中各有9个CpG位点,其余位于2个CpG岛之间。Island 1的甲基化频率在大蒲莲和长白猪两群体间差异不显著(P>0.05),Island 2的甲基化频率大蒲莲猪群体显著高于长白猪群体(P<0.05)。2)Island 2中甲基化频率与ΔCt值成正相关,即甲基化频率与基因表达量成负相关,其中+126、+128、+159、+162和+164是重要的甲基化位点。3)两个猪群体中位于Island 2的+159和+164位点与CD4+CD8+CD3+指标显著正相关(P<0.05)。Island 2中+159和+164位点甲基化频率与基因表达量成负相关,而且这2个位点又与T淋巴细胞亚群CD4+CD8+CD3+显著正相关,笔者推测,大蒲莲仔猪TNFRSF1A基因+159和+164位点的甲基化频率增加,可能导致TNFRSF1A基因表达量下降,影响T淋巴细胞亚群性状,从而影响机体的免疫水平。