基于DIA LC-MS对Ⅲ期食管鳞癌和食管良性疾病患者外周血外泌体差异蛋白的研究

目的研究Ⅲ期食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)患者与食管良性疾病患者外周血外泌体蛋白组学的差异。方法基于数据非依赖性采集高分辨率色谱-质谱技术(data independent acquisition liquid chromatography-mass spectrometry, DIA LC-MS),比较3例Ⅲ期ESCC患者与3例食管良性疾病患者外周血外泌体蛋白种类的差异,并对这些差异蛋白进行生物信息分析。结果通过透射电镜、纳米粒子示踪分析、免疫印迹法鉴定提取粒子为外泌体,在2组样品中共检测到1 018个蛋白。通过对比蛋白图谱,共发现21个差异蛋白。富集分析结果表明功能组分中主要涉及细胞黏附和代谢,细胞组分中主要是胞质成分。而在分子功能中涉及多个酶活性。在对这些差异蛋白进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析后显示:叶酸代谢通路、核糖体蛋白质等代谢过程有差异。结论基于DIA LC-MS技术对Ⅲ期食管鳞癌患者和食管良性疾病患者外泌体差异蛋白分析显示,代谢通路可能在食管癌发生发展中发挥重要作用。

定量磷酸化蛋白质组解析17β-雌二醇致死效应的细胞调控过程

17β-雌二醇(E2)是人体内一种重要的内分泌激素,在生理浓度下(0.2~1.0 nmol/L)对生殖系统、乳腺等靶器官的生长发育起着重要的调节作用。但很多研究表明,高剂量(μmol/L~mmol/L)的E2能够诱导肿瘤组织消退和细胞凋亡,其具体调控机制尚不明确。本工作聚焦于高剂量(μmol/L)的E2致死效应,首先分析了μmol/L水平的E2对HeLa细胞表型的影响,发现在1~10μmol/L下E2以浓度依赖的形式抑制HeLa细胞增殖,并诱导HeLa细胞发生死亡,其中,用5μmol/L E2处理2天后可使约74%的HeLa细胞增殖受到抑制,并引起约50%的HeLa细胞死亡。在此基础上,为了探究高剂量E2诱导细胞死亡的内在调控过程,将基于固相萃取(SPE)的固定化钛离子亲和色谱技术(Ti 4+-IMAC)与基于数据非依赖采集模式(DIA)的蛋白质组定量技术结合,用于筛选HeLa细胞内参与高剂量(μmol/L)E2致死效应调控过程的磷酸化位点。最终,在5μmol/L E2和二甲基亚砜(DMSO)处理的HeLa细胞中共鉴定到超过10000个磷酸化位点;t检验分析发现,在E2处理后,有924个磷酸化位点(对应599个蛋白质)的丰度发生了显著变化(显著性水平(p)<0.01,|log 2(倍数变化)|≥1),推测其可能参与调控E2致死效应过程。此外,有453个磷酸化位点(对应325个蛋白质)仅单独发生在E2或DMSO处理后的HeLa细胞样品中,表明这些磷酸化位点在E2处理后发生了磷酸化或去磷酸化,也可能参与E2致死效应的调控过程。分别对以上两种方式筛选的E2调控的磷酸化蛋白质进行富集分析,发现这些磷酸化蛋白质主要参与细胞分裂、核糖体/核质转运、信使核糖核酸(mRNA)加工/剪接及转录等过程,表明高剂量的E2可能通过调控核糖体及mRNA加工等过程影响蛋白质转录,进而诱导细胞发生死亡。此外,我们发现表皮生长因子受体(EGFR)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族蛋白(包括MAPK1、MAPK4和MAPK14)上多个磷酸化位点的修饰水平在高剂量E2处理后发生了明显变化,表明EGFR和MAPK信号通路可能在雌激素诱导的细胞死亡中起着重要调控作用。本实验得到的磷酸化蛋白质组定量结果有助于进一步了解高剂量E2的内在调控过程,为后续解析高剂量E2的作用机制及疾病的治疗提供了参考。

基于质谱的单细胞蛋白质组学分析

单细胞蛋白质组学分析能揭示细胞个体之间蛋白质的精细差异,在诸多重要领域具有重要的应用价值,已成为目前的研究热点;其难点在于单细胞内的蛋白质极其微量,需要解决样品处理过程中的损失问题、色谱质谱检测的灵敏度问题和低信号强度质谱数据的解析利用问题.本文从单细胞分选、样品处理、色谱质谱采集和数据分析等方面,综合评述了目前基于质谱的单细胞蛋白质组学分析方法的研究进展及其在生物医学领域的应用,并展望了其未来的发展前景.

基于数据非依赖型采集蛋白质组学分析劳力性热射病大鼠血浆蛋白的变化

目的采用数据非依赖型采集(DIA)蛋白质组学技术分析劳力性热射病(EHS)大鼠血浆蛋白表达的变化。方法取SPF级雄性SD大鼠10只,随机分为正常对照组(CON组,n=5)和EHS组(n=5),EHS组造模前1周完成温度遥测胶囊植入术,术毕恢复7 d后大鼠在人工气候舱内(温度40℃,相对湿度70%)跑步,监测核心温度达到42.5℃时视为发生EHS。停止跑步后采血进行DIA定量蛋白质组学分析。结果以表达倍数>1.5倍且P<0.05为筛选标准,共筛选出625个上调差异表达蛋白(DEPs)和8个下调DEPs。亚细胞定位注释表明,DEPs主要位于细胞外和细胞质;基因本体论(GO)注释显示,DEPs分子主要功能为蛋白质结合;京都基因与基因组百科全书(KEGG)注释显示,DEPs主要参与免疫反应、能量代谢等信号通路;同源蛋白簇(COG)注释显示,DEPs主要发挥翻译后修饰、蛋白质周转和伴侣功能。蛋白结构域富集分析显示,DEPs结构域主要集中在免疫球蛋白结构域、血小板反应蛋白1型结构域和补体Clr样EGF样结构域;GO富集分析显示,DEPs主要参与血液凝固和纤维蛋白凝块形成、纤溶酶原激活、急性炎症反应的调节等过程;KEGG富集分析显示,DEPs主要参与补体和凝血级联、免疫和细胞黏附分子等信号通路;Reactome通路富集分析显示,DEPs主要参与先天免疫系统、中性粒细胞脱颗粒和血小板活化等信号通路;蛋白互作网络分析发现,参与补体和凝血级联通路的蛋白网络互作较多,且以上调蛋白Fgg、Plg和Serpinc1为主。结论EHS明显改变大鼠血浆中蛋白表达谱,主要涉及免疫系统异常激活、炎症反应失控和凝血功能紊乱的信号通路。

数据非依赖采集张量质谱数据计算平台的开发

数据非依赖采集张量(data independent acquisition tensor,DIAT)是一种质谱数据格式,用于处理和分析数据非依赖采集方法获得的蛋白质组学数据。与传统方法相比,DIAT技术具有便捷的数据可视化处理和高效的深度学习模型训练等优势。但由于目前缺乏支持DIAT格式数据的软件平台,限制了其应用。为解决这一问题,本文基于PyQt框架设计了一款用于处理和分析DIAT数据的软件,涵盖了与DIAT技术相关的所有功能,使用户能够轻松地利用DIAT数据进行复杂分析,降低了使用门槛,为数据非依赖采集(DIA)质谱数据分析注入了活力。

标志物研究中常用蛋白组学质谱方法的定量准确性评估

在疾病发生过程中,蛋白质的表达水平、修饰状态或相互作用模式的变化有可能反映病理状态或疾病进展,因此蛋白质常被用作疾病标志物.基于质谱的蛋白质组学发现了大量的潜在疾病标志物,这些标志物及其质谱检测方法能否进一步推广至临床检测,定量准确性和稳定性是关键.本文合成了32条标准肽段,对数据非依赖性采集(DIA)、多反应监测(MRM)及平行反应监测(PRM) 3种有潜力在临床质谱方面大规模应用的定量方法进行了比较和评估.将肽段稀释成4个不同的浓度来模拟不同丰度的实际样本,用以上3种质谱方法采集数据后,比较了肽段发现率、标准曲线线性、日间和日内精密度及保留时间(RT)漂移等情况,总结了3种定量方法各自的优缺点和潜在应用方向.结果表明,MRM定量方法最适合临床应用,在于其优异的日间日内稳定性、灵敏度和定量精度;PRM适合科研方向靶向定量,因其拥有最高灵敏度和较高稳定性定量精度;而DIA由于高通量而依赖于软件和算法解析,定量数目多的同时,对于特定肽段定量准确性比PRM/MRM差.

以信息化建设为牵引 扎实推进实验室建设

目前的高等教育,越来越强调对学员实践能力的培养,而传统的实验项目以及上课时间、地点的局限性很难满足学员的需求;以信息化为牵引,建设基于校园网的实验室综合信息处理平台,是实验室建设、实验教学与管理由传统模式向教育现代化转型的重要标志[1]。我院电子技术实验中心经过"2110工程"二期建设和实验室标准化建设,改善了基础实验教学条件和信息化教学条件,建立了网上实验室开放预约管理系统,使实验教学从原来"集中安排,以教为主"到现在"自主预约,以学为主"。经过近几年的实践证明,以信息化引领实验室建设突出了学员在教学活动中的主体作用,培养了学员创新能力,提高了实验教学质量。

定量蛋白质组学质谱采集技术进展

质谱是定量蛋白组学的主要工具。近年来随着定量蛋白质组学研究的深入,传统质谱定量技术面临着复杂基质干扰、分析通量限制等诸多问题。而最近一系列质谱新技术的发展,包括同步母离子选择(SPS)、质量亏损标记、平行反应监测(PRM)、多重累积(MSX)和多种全新数据非依赖性采集(DIA)等,为解决目前蛋白质组学在相对定量和绝对定量分析方面的局限提供了有效途径。本文对定量蛋白质组学目前遇到的瓶颈问题进行了分析,总结了质谱定量采集技术的最新进展,并评述了这些新技术的特点以及在定量蛋白质组学应用中的优势。

创新数据非依赖性采集用于复杂基质目标蛋白质的定量分析

数据非依赖性采集（ DIA）是随着定量蛋白质组学而建立的质谱扫描技术。 DIA能够获得扫描范围内所有母离子及二级子离子信息,不会造成低丰度离子信息的丢失,同时突破了高分辨质谱二级定量的通量限制。本研究基于静电场轨道阱Q-qIT-OT三合一质谱,发展了经典DIA方法以及WiSIM-DIA和Full MS-DIA两种全新DIA方法,并对Hela细胞全蛋白中添加的10条低浓度肽段进行定量分析,考察方法的线性、重现性和灵敏度。结果表明,3种方法的定量限均低至amol （14～435 amol）,并展示出良好的线性和定性确证可靠性。其中,WiSIM-DIA基于超高分辨一级监测定量,与经典DIA优势互补；Full MS-DIA的选择窗口仅3 amu,能够直接进行搜库鉴定,实现了数据依赖性采集（ DDA）和DIA的统一,摆脱了DIA依赖于DDA建立谱图库的局限性。

基于数据非依赖采集质谱技术对下肢动脉硬化闭塞症合并急性动脉血栓形成的血浆蛋白质组学的研究

目的 应用数据非依赖采集质谱(DIA-MS)技术研究下肢动脉硬化闭塞症(LEASO)合并急性动脉血栓形成患者的血浆蛋白质组学,探索LEASO合并急性动脉血栓形成的潜在发病机制。方法 收集2020年1—5月德阳市人民医院收治的10例LEASO合并急性动脉血栓形成患者和10例健康体检者的血浆,分别为血栓形成组和健康对照组,采用混样方式,确保每组3例生物学重复。先通过DIA-MS技术进行数据采集和分析,再针对差异蛋白进行基因本体论(GO)功能富集分析、京都基因和基因组数据库(KEGG)通路富集分析,并构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络图,最后采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对血浆Serpin家族成员1(SERPINA1)蛋白的表达进行验证。结果 与健康对照组相比,血栓形成组共有112个差异蛋白,包括61个表达上调的蛋白和51个表达下调的蛋白。差异蛋白富集分析结果显示,多个与动脉粥样硬化及血栓形成相关的GO条目和KEGG信号通路被显著富集。PPI网络图分析结果显示,连通数目最多的3个蛋白分别为甲状腺素运载蛋白(TTR)、触珠蛋白(HP)和SERPINA1。ELISA结果显示,血栓形成组患者SERPINA1蛋白的浓度高于健康对照组患者,差异有统计学意义(P﹤0.05)。结论 利用DIA-MS技术研究LEASO合并急性动脉血栓形成患者的血浆蛋白质组学是可行的,筛选出来的差异蛋白可能参与了LEASO合并急性动脉血栓形成的病理过程,其中,SERPINA1蛋白可能是参与该过程的关键蛋白之一。

基于模型设计的4WIS-4WID车辆教学实验平台

提出一种具有线控转向功能的4WIS-4WID电动车实验平台,用于该车辆的研究及教学。首先分析了该车辆的结构及工作原理,设计了控制系统结构,然后设计了实验平台的测控方案。为了提高实验平台控制系统的开发效率及使用便利,实验平台采用基于模型的设计方法,该方法能直接从仿真程序自动生成底层应用代码。在实验数据采集方面,采用Lab VIEW编写数据采集系统。最后利用实验验证了所设计的实验平台的有效性。它为4WIS-4WID车辆的研究与多个实验项目的教学与实践提供了平台,也为基于模型设计的控制系统开发方法在高校课堂教学提供了实践经验。

精密电位计独立线性度自动测试系统的设计

为了实现对精密电位计独立线性度参数进行高精度、高自动化的测试,利用运动控制技术和虚拟仪器技术,结合最小二乘线性拟合算法,设计实现了一种电位计独立线性度自动测试系统。测试结果分析表明,该测试系统能够达到某军标要求,测试精度达到0.1°,自动化程度高,满足实际工程应用提出的测试要求,体现了测试系统的优越性和实用价值。

中国石化节点采集技术应用进展与展望

2014年以来,随着国际市场原油价格的低迷和高密度地震采集技术的推广应用,油公司和油服公司面临巨大的采集作业成本压力。地震节点仪器因其适应复杂地表施工、适应灵活观测系统部署、施工效率高、HSE风险小、作业成本低等优势而得以迅速发展,地震节点采集技术成为国内外地震勘探行业研发和应用的热点之一。此外,节点仪器比有线仪器价格低,适应“单点、高密度、大道数”采集技术发展趋势。近年来,中国石化持续推进节点仪器及节点采集技术的研发与应用。介绍了中国石化地球物理公司研发的第一代、第二代I-Nodal节点采集系统性能特点,总结了节点采集技术在中国石化的应用进展。结合节点与有线仪器混合采集、全节点独立采集以及全节点与激发新技术配套采集等多种作业模式,展示了其应用效果。与有线采集相比,节点采集面临着数据无法实时回传、噪声无法实时监控等难题。为适应油气勘探高密度、高效率、低成本施工需求,节点采集将向小型化、轻量化、低成本化、自动化方向发展。面临高密度、高效率、低成本物探采集技术需求,节点采集展现了广阔的应用领域和良好的应用前景。

利用局部坐标系进行横断面测量的一种方法

通过建立局部坐标系,进行横断面测量的一种方法。这种方法具有灵活简便、劳动强度小、效率高的特点,特别适合高差变化大的地区。

EAST现场高速数据采集子系统

针对现有EAST采集系统信号存在衰减、采样率较低、数据格式不通用等问题,提出现场采集的概念,设计并实现EAST现场高速数据采集子系统。系统使用高速同步采集卡PXI2022,结合RAID0磁盘存储技术,其数据存储采用核聚变领域通用的软件工具MDSplus。实验结果证明,该系统能够较好地解决原有系统存在的问题。

基于数据非依赖采集的蛋白质组质谱数据解析方法研究进展

数据非依赖采集(DIA)是蛋白质组学领域近年来快速发展的质谱采集技术,其通过无偏碎裂隔离窗口内的所有母离子采集二级谱图,理论上可实现蛋白质样品的深度覆盖,同时具有高通量、高重现性和高灵敏度的优点。现有的DIA数据采集方法可以分为全窗口碎裂方法、隔离窗口序列碎裂方法和四维DIA数据采集方法(4D-DIA)3大类。针对DIA数据的不同特点,主要数据解析方法包括谱库搜索方法、蛋白质序列库直接搜索方法、伪二级谱图鉴定方法和从头测序方法4大类。解析得到的肽段鉴定结果需要进行可信度评估,包括使用机器学习方法的重排序和对报告结果集合的假发现率估计两个步骤,实现对数据解析结果的质控。本文对DIA数据的采集方法、数据解析方法及软件和鉴定结果可信度评估方法进行了整理和综述,并展望了未来的发展方向。

数据不依赖获取的质谱数据的深度学习分析方法

近年来,数据不依赖获取(data-independent acquisition,DIA)质谱技术在蛋白质组学领域内被广泛关注.然而DIA质谱数据具有维度高、背景噪声大、多种信号混合等特点,这使得DIA质谱数据的分析成为一大挑战.本文提出一种基于深度学习的可直接处理DIA质谱数据的算法:Ultra-DIA.该算法使用深度变分自动编码器提取离子信号的特征来区分不同肽段产生的子离子,最终生成虚拟谱图,进而对肽段和蛋白进行定性和定量分析.对于测试数据,该算法找到的肽段数量和蛋白数量比主流算法DIA-Umpire分别多61.4%和64.5%.此外,相较于DIA-Umpire,该算法能够找到更多低浓度的蛋白.

鉴定合并急性主动脉夹层的主动脉瓣二叶畸形患者差异表达蛋白的蛋白质组学研究

目的探讨急性主动脉夹层(AAD)-主动脉瓣二叶畸形(BAV)患者体内特异性的基因或蛋白质的表达情况。方法选取2021年2月至6月于安徽医科大学第一附属医院心脏大血管外科就诊并接受治疗的5例AAD-BAV患者和6例单纯性BAV患者,分别入选实验组及对照组。使用数据非依赖采集(DIA)蛋白组学技术分析了两组患者主动脉组织的差异蛋白表达情况,并通过生物信息学手段明确了差异蛋白的生物学功能及参与的异常信号通路。结果共鉴定出467个上调蛋白和481个下调蛋白。基于GO、KEGG数据库的差异表达蛋白富集分析揭示了差异蛋白主要参与了黏着斑、ECM受体相互作用、补体和凝血级联、剪接体、氧化磷酸化等相关信号通路。结论AAD-BAV患者主动脉组织内差异蛋白表达具有独特特征,其中许多差异蛋白是疾病发生和进展的关键蛋白,为未来疾病的早期诊断、精准治疗提供了参考依据。

子痫前期患者血清和尿液中差异蛋白分析

目的分析子痫前期(PE)患者与正常妊娠孕妇外周血、尿液标本蛋白质组学的差异。方法留取2019年9—12月就诊北京协和医院的PE患者(P组,n=5)和同期正常妊娠的孕妇(C组,n=7)产前、产后24 h外周血清及尿液样本,用质谱技术鉴定样本中的蛋白,采用数据非依赖采集模式(DIA)蛋白质组学定量方法筛选差异蛋白,并对筛选出的差异蛋白进行生物信息学分析。结果通过DIA技术,以组内产前产后对比,筛选出血清中差异蛋白274个,其中P组84个,上调67个,C组190个,上调73个;尿液中差异蛋白671个,其中P组449个,上调224个,C组222个,上调105个。生物信息学分析结果显示,与C组相比较,P组差异蛋白在炎症免疫反应、内皮损伤、细胞增殖和血管发生相关信号通路异常,可以激活肾素-血管紧张素信号通路、肾上腺髓质素信号通路、心肌肥厚信号通路、铁死亡信号通路。结论蛋白质组学研究可以筛选出PE与正常妊娠之间的差异蛋白,这些差异蛋白通过多种信号通路途径参与PE发生、发展及相关损伤。

基于数据非依赖采集的无色谱数据处理软件系统

目的如何高效准确地定量蛋白质一直是蛋白质组学的主要关注点,基于液相色谱-数据依赖模式进行谱图采集的质谱方法是目前主流的蛋白质测定方式。但是,当面对复杂样本中蛋白质定量的对比实验,为了使肽段得到有效分离,使用较长时间色谱洗脱的方法占据了谱图生成的大量时间。为了解决此问题,并且能够高效、准确地定性定量肽段,提出一个基于数据非依赖采集(data-independent acquisition,DIA)的无色谱数据处理软件系统。方法基于以肽段为中心的蛋白质定量理念,利用现有解决混合图谱的方法对无色谱DIA质谱数据进行定性,随后仿照DIA方法下色谱面积的计算方法完成定量;最后基于分类模型,对最终结果给出统计分析控制。结果本系统能够处理生成无色谱的DIA质谱数据,并且在12 min内从海拉(Henrietta Lacks,Hela)蛋白质样本中定性定量出1954个肽段。结论使用本系统处理无色谱质谱数据,相比于DIA质谱数据,能够在更短的时间内准确定量出足够的肽段,对于在有限时间内测定大规模蛋白质样本有重要的意义。