常染色体DAZL基因单核苷酸多态性与男性不育相关性研究

目的:探讨常染色体DAZL基因单核苷酸多态性(SNP)与男性不育的关系。方法:收集东北地区男性不育症患者(不育组,n=144)和健康并已育有一子女的男性(生育组,n=53)精液标本,不育组按照WHO(1999)少、弱和畸形精子分类标准分成少弱畸形精子症组(n=17)、少弱精子症组(n=33)、弱畸形精子症组(n=13)、弱精子症组(n=54)和非少弱畸形精子不育症组(n=27),应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)筛选SNP260多态性,应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)筛选SNP386多态性,并测序验证和进行统计学分析。结果:不育组及生育组中均检测到SNP260A→G多态性,统计学分析差异无显著性(P>0.05),但在少弱畸形精子症组SNP260AG基因型比例大于其他各组;各研究组均未发现SNP386多态性。结论:SNP260和SNP386多态性与中国东北地区男性不育无相关性。前者AG基因型与少弱畸形精子的关系尚需进一步证实;后者多态性可能仅分布在台湾的一些狭小地区,两者均不能作为东北地区男性不育基因诊断的分子标志。

Real-time PCR检测黄牛、牦牛、犏牛睾丸组织中Boule、Dazl基因mRNA表达

旨在探讨DAZ基因家族Dazl和Boule基因与犏牛雄性不育的关系。采用实时荧光定量PCR技术检测黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织中DAZ基因家族Boule和Dazl基因mRNA表达并进行分析。结果表明,Boule和Dazl熔解曲线扩增产物呈现单特异峰,具有较高的灵敏度和特异性;标准曲线显示Ct值与重组质粒浓度间线性关系良好,相关系数均大于0.999;mRNA表达分析显示,3种牛中Dazl基因在犏牛睾丸组织中表达量最低,其中黄牛与牦牛、黄牛与犏牛差异显著(P<0.05),犏牛与牦牛差异不显著(P>0.05);Boule基因在3种牛睾丸组织中的表达量显示,黄牛与牦牛差异不显著(P>0.05),黄牛、牦牛与犏牛差异显著(P<0.05)。结果提示,Dazl和Boule基因可作为研究犏牛雄性不育的候选基因。

山羊DAZL基因的克隆及在山羊骨髓间充质干细胞中的表达

本研究以山羊睾丸组织为材料,用RT-PCR法成功克隆了山羊DAZL基因的cDNA序列950 bp,测序和生物信息学分析表明,其含有885 bp的完整开放阅读框(ORF),编码295个氨基酸,与牛的氨基酸序列同源性为97.97%,编码产物含有典型的RNA识别基序RRM和DAZ重复基序;将山羊DAZL基因亚克隆至表达载体pEGFP-C1上,构建了山羊DAZL基因真核表达载体pEGFP-DAZL,采用脂质体法将其瞬时转染至山羊骨髓间充质干细胞(BMSC)中,通过荧光显微镜观察确定重组质粒在山羊BMSC内的表达和定位。

牦牛DAZL基因编码区的克隆和序列特征与进化分析

根据黄牛DAZL基因序列设计引物,通过PCR扩增和克隆测序获得牦牛睾丸组织DAZL基因编码区序列,利用生物信息学软件分析牦牛DAZL基因编码区序列结构以及与其他物种的系统发育关系。结果表明:牦牛DAZL基因cDNA序列长度为1 782 bp,编码区全长885 bp,编码295个氨基酸,与黄牛的氨基酸序列同源性为98.31%;牦牛DAZL蛋白含有DAZ基因家族所具有的典型的RNA结合域和DAZ重复基序。系统发育分析显示:牦牛与黄牛首先聚为一类,然后与哺乳纲的其他物种相聚,而与鱼纲、爬行纲动物的亲缘关系最远。

利用液相芯片技术研究DAZL基因单核苷酸多态性与男性不育关系

目的建立液相芯片检测DAZL基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)的方法,并探讨该基因SNP与男性不育的相关性。方法实验分为由无精症和严重少精症组成的病例组与健康自愿者组成的对照组,基于Luminex技术平台,应用等位基因特异性延伸反应(allele specific pri mer extension,ASPE),研究DAZL基因SNP260A→G和SNP386A→G的突变情况。结果196例病例中SNP260A→G和SNP386A→G突变分别为6例(3.06%)和4例(2.04%),40例对照组中只有1例(2.5%)SNP260A→G突变,没有发现SNP386A→G突变。所有突变均为突变纯合体,且没有发现同时存在两个突变的标本。两个位点的突变频率在病例组和对照组间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论成功建立并应用液相芯片检测单核苷酸多态性的方法;DAZL基因SNP260A→G和SNP386A→G突变与成都地区男性不育没有明显相关性。

DAZL基因单核苷酸多态性与弱畸精子症的相关性研究

目的:探讨DAZL基因(deleted in azoospermia like)单核苷酸多态性(SNP)与弱精子症伴畸形精子症男性不育的关系。方法:收集弱畸精子症不育患者(病例组,n=173)和精液正常男性(对照组,n=175)精液样本,进行精液常规及精子形态学分析并提取精子基因组DNA,应用Sequenom MassARRAY SNP分型技术对DAZL基因A260G和A386G多态性位点进行基因分型,比较病例组与对照组基因型的分布差异。结果:在病例组与对照组中,DAZL基因A260G、A386G这两个位点均表现为野生基因型,无突变基因型。结论:DAZL基因A260G和A386G两个多态性位点与汉族男性精子活力低下及精子形态异常所致不育可能不存在相关,不足以视为男性不育的易感基因。

DAZL基因与男性不育关系的研究进展

DAZL基因为DAZ基因家族成员之一,在人类精子发生的过程中,DAZL基因发挥着至关重要的调控作用。基因DAZL通过其表观遗传学修饰作用,主要是DAZ的甲基化,调控基因启动子来实现DAZL基因在生殖细胞中的表达。DAZL基因多态性位点分析(SNP)与男性不育依旧是一个值得探讨的研究方向,目前认为与地域和种族有关。本文通过总结近来的相关研究资料,阐述精子发生过程中的DAZL基因甲基化状态的改变以及DAZL的SNPs与男性不育之间的联系,为男性不育的治疗提供新的理论基础和临床思路。

浙江地区无精子症和少弱精子症患者DAZL基因A260G和A386G单核苷酸多态性分析

目的：探讨浙江地区人群中DAZL基因A260G和A386G单核苷酸多态性（SNP）与无精子症和少弱精子症的关系。方法：收集浙江地区无精子症和少弱精子症患者317例和正常生育男性246例外周血标本,利用SNa Pshot SNP分型技术对样本DAZL基因Q260G和A386G多态性位点进行分型。结果：DAZL基因A260G在浙江地区汉族人群中具有多态性,其基因频率与基因型频率分布在病例组和对照组中均符合Hardy-Weinberg平衡。AA、AG和GG的基因型频率在对照组中分别为92.3%、7.3%和0.4%,而病例组中分别为94.3%、5.7%和0%,统计学分析无显著性差异（P=0.430,OR=0.780,95%CI=0.413～1.46）。A386G突变只在正常对照组中出现1例杂合子AG,两组中都没有发现纯合子GG突变,两组之间亦无显著性差异（P=0.259,OR=0.698,59%CI：0.374～1.306）。结论：DAZL基因Q260G和A386G多态性与中国浙江地区无精子症和少弱精子症无相关性,两者都不能作为无精子症和少弱精子症遗传诊断的分子标志。

鸡Dazl基因启动子活性检测及其诱导剂的初步筛选

论文旨在确定Dazl基因核心启动子活性调控区,并比较不同诱导剂的诱导效率,筛选出最佳基因诱导剂。用PCR技术扩增不同长度的Dazl基因启动子,插入到pEGFP-N1和/或pGL3-basic载体中,构建重组载体;再将这些重组载体分别转染DF-1细胞系和GC-1细胞系,使用双荧光素酶报告基因检测系统测定其转录活性,确定Dazl基因启动子核心活性区域;添加单因素或多因素诱导因子,比较不同诱导剂以及诱导剂组合对鸡Dazl基因启动子活性的影响大小。如皋黄鸡Dazl基因的-932bp^-186bp区域在DF-1和GC-1两种细胞中,都有不同程度的启动活性,而-186bp^-39bp启动子活性几乎完全丧失;诱导剂筛选结果表明,FSH+E2组和Am80组、E2组能够显著提高Dazl基因启动子的活性,RA组、ATRA组、FSH组和睾酮组都不同程度地提高了启动子的活性,而睾丸提取液和BMP4对启动子活性没有显著影响。通过体外诱导实验筛选出如皋黄鸡Dazl基因最适诱导剂,为鸡ESCs体外向雄性生殖细胞分化的细胞诱导剂进一步筛选奠定了基础。

牛DAZL基因序列分析、克隆及表达载体构建

利用生物信息学方法对牛DAZL基因的一级结构和同源性进行分析,并根据牛DAZL基因序列设计引物来克隆该基因,通过酶切、连接、转化构建该基因的表达载体,成功克隆到了DAZL基因。生物信息学分析结果显示,哺乳动物的DAZL基因同源性很高。此外,构建了牛DAZL基因的带绿色荧光蛋白的真核表达质粒p EGFP-N3-DAZL。

水貂DAZL基因的DNA池测序分析

选取短毛黑、银兰、红眼白水貂构建品种DNA池。扩增DAZL基因部分序列,对扩增产物测序。从测序结果分析可以看出,不同品种水貂间的DAZL基因部分序列完全一致;同源性表明,水貂与雪貂同源性很高(94.2%),与猪、犀牛、骆驼、江豚同源性较高(80.8%～81.8%),与牛的同源性较低(77.4%)。系统进化树显示,水貂与雪貂属同一分支。

小鼠Dazl基因真核表达载体的构建及表达检测

为研究小鼠Dazl基因的功能及探究Dazl基因过表达在干细胞向生殖细胞分化过程中的作用,采用RTPCR方法,从13.5 dpc雌性胎鼠卵巢中克隆出Dazl基因的全部编码区,测序正确后利用限制性内切酶将其连接到真核表达载体pc DNA3.1上。线性化后对小鼠成纤维细胞进行转染,qRT-PCR及Western Blot技术显示外源基因Dazl已经成功转染并表达。为研究Dazl基因的功能及干细胞向生殖细胞的诱导分化奠定了基础。

小鼠Dazl基因融合蛋白表达载体的构建及转染

根据NCBI数据库上公布的小鼠Dazl基因的mRNA序列设计引物,以小鼠睾丸组织RNA为模板,RT-PCR扩增小鼠Dazl基因编码区片段,并将其克隆到增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1中,构建重组融合蛋白表达载体pEGFP-C1-Dazl,单双酶切和测序验证正确。将pEGFP-C1-Dazl质粒转染293和NIH-3T3细胞,荧光显微镜下观察到融合表达的绿色荧光蛋白,且呈胞质表达;对照组转染pEGFP-C1,绿色荧光遍布整个细胞。Dazl蛋白的免疫荧光试验也证明重组载体转染后,Dazl基因和GFP共同定位于胞质部分。pEGFP-C1-Dazl融合蛋白表达载体的成功构建为进一步研究生殖特异性基因Dazl在小鼠和大型动物的表达特性奠定了一定的基础。

含鸡生殖细胞标志基因DAZL的慢病毒表达载体构建

为了构建含目的基因的慢病毒表达载体,包装成病毒并检测病毒感染情况,试验采用PCR技术和Multi Site Gateway技术构建含DAZL基因的慢病毒表达载体p Lenti6.4/EF1α/V5/DAZL并制备慢病毒。结果表明：试验成功构建了含目的基因DAZL的慢病毒表达载体,并制备出有感染能力的慢病毒。说明试验构建的慢病毒表达载体适用于含目的基因DAZL的慢病毒生产。

猪类无精症缺失基因DAZL的cDNA全长克隆、组织表达和亚细胞定位

旨在获得猪类无精症缺失基因DAZL cDNA全长序列,阐明该基因的序列、mRNA组织表达模式、蛋白质结构特征及亚细胞定位情况。本研究以版纳微型猪近交系(Banna mini-pig inbred line,BMI)10月龄成年公猪为研究对象,屠宰收集组织样,利用RACE和RT-PCR技术获得DAZL基因cDNA全长序列;使用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测其mRNA多组织表达谱;在线分析蛋白质的结构特点和保守结构域;用体外细胞转染技术鉴定其在ST猪睾丸细胞中的定位。结果表明,BMI DAZL cDNA全长2985 bp(KU705632),包含888 bp的CDS区,编码295个氨基酸(AOC89050);该基因位于猪13号染色体,含11个外显子。qPCR结果显示,DAZL mRNA在睾丸中特异高表达。生物信息学分析表明,猪DAZL蛋白含有哺乳动物RMP和DAZ同源区,无规则卷曲在二级结构中超过50%。进化分析表明,BMI DAZL氨基酸序列高度保守,与牛科的亲缘关系最为接近。pEGFP-C1-DAZL转染ST细胞后的荧光共定位结果显示,DAZL蛋白主要分布在细胞核中。本研究分别从DNA、mRNA和蛋白质层面阐明了BMI DAZL基因的序列特征、表达、蛋白质结构和定位,为进一步研究DAZL在BMI精子发生方面的功能奠定基础。

少弱精子症患者DAZL基因DNA甲基化分析

目的比较正常生育男性及少弱精子症患者DAZL基因启动子区域DNA甲基化水平的差异。方法采用病例对照研究,回顾性分析2018年6月至2019年6月期间于徐州医科大学附属连云港医院就诊的具有正常生育男性(对照组)15例和少弱精子症患者35例(少弱精子症组)的临床资料,对精液标本进行精子形态与精子浓度、活力分析。提取精液基因组DNA行亚硫酸氢盐处理,利用PCR体外扩增并将PCR产物经纯化后与pCR2.1载体连接及酶切验证,挑选阳性克隆进行测序和DNA甲基化程度差异比较。结果对照组DAZL基因启动子均呈低甲基化水平,甲基化率为0.96%±0.46%,少弱精子症组甲基化率为12.15%±11.35%,组间差异有统计学意义(P=0.0004);DAZL基因甲基化率在少弱精子症组患者中个体差异明显,有12例(34.3%)患者DNA甲基化水平超过10%。结论DAZL基因启动子区域甲基化异常可能和少弱精子症有关,有望成为男性生精缺陷的生物学标志之一。

1个AZFc缺失自然遗传的家系分析

目的:报告1个父子间AZFc缺失自然遗传的罕见家系,探讨该家系相同缺失类型导致不同临床表型的可能机制。方法:应用G显带技术进行染色体检查;通过对12个序列标签位点(STS)的多重PCR扩增,检测Y染色体微缺失;应用DNA测序技术检测DAZ基因在常染色体上的同源基因DAZL单核苷酸多态性(SNP)。结果:先证者及其父亲和弟弟的核型均为46,XY,且Y染色体微缺失位点完全一致,包括无精子症因子C区(AZFc)的sY152,sY157,sY242,sY254,sY255,sY239。但3者的临床表型各异:父亲具有正常生育能力,先证者及弟弟均不育,精子密度呈年龄依赖性下降,且弟弟伴左侧隐睾。SNP分析显示,3者的外显子2、3的基因型均相同。结论:该家系中相同缺失类型导致不同临床表型与DAZL基因多态性无关,可能与其他基因或环境因素有关。