DDX1基因对神经母细胞瘤细胞侵袭、迁移及耐药能力的影响

目的 探讨dead box 1（DDX1）基因对神经母细胞瘤（NB）细胞侵袭、迁移及耐药能力的影响。 方法 根据病毒滴度在2孔细胞中分别加入适宜量的目的病毒（Lenti-DDX1-MIR病毒液，滴度1012 TU/L）和阴性对照病毒（Lenti-EGFP病毒液，滴度3×1011 TU/L）[感染复数（MOI）＝10]。将生长状态良好、处于对数生长期的空细胞[SK-N-BE（2）/blank]、阴性对照组细胞[SK-N-BE（2）/shV]和干扰DDX1组[SK-N-BE（2）/shDDX1]细胞进行培养。用Transwell法检测细胞侵袭能力，并用结晶紫对细胞进行染色，每个小室选取5个视野计数，取平均值计算细胞的侵袭率。用Transwell法检测细胞迁移能力，并用结晶紫对细胞进行染色，用酶标仪检测570 nm处的吸光度值，然后计算细胞迁移能力。称取50 mg顺铂，用5 mL二甲基亚砜（DMSO）溶剂溶解配制成质量浓度为10 g/L的母液备用；称取50 mg多柔比星，用PBS溶剂溶解配制成质量浓度为1 g/L的母液备用。将药物加入细胞培养板，达到终浓度，其中多柔比星终质量浓度为1.0 mg/L，顺铂终质量浓度为2.5 mg/L，药物处理24 h，然后拍照记录。CCK-8检测细胞对多柔比星和顺铂的敏感性变化。 结果 Transwell实验结果显示，SK-N-BE（2）/shDDX1细胞侵袭的细胞量只有SK-N-BE（2）/blank及SK-N-BE（2）/shV细胞的60%；结晶紫染色显示，SK-N-BE（2）/shDDX1细胞的侵袭能力弱于SK-N-BE（2）/blank细胞及SK-N-BE（2）/shV细胞的侵袭能力，即DDX1敲减后SK-N-BE（2）细胞的侵袭能力减弱。Transwell实验结果显示，SK-N-BE（2）/shDDX1细胞的迁移能力只有SK-N-BE（2）/blank及SK-N-BE（2）/shV细胞的50%；结晶紫染色显示，SK-N-BE（2）/shDDX1细胞的迁移能力弱于SK-N-BE（2）/blank细胞及SK-N-BE（2）/shV细胞的迁移能力，即DDX1敲减后SK-N-BE（2）细胞的迁移能力减弱。DDX1基因敲减后，1.0 mg/L的多柔比星对SK-N-BE（2）/shDDX1细胞24 h的抑制率为SK-N-BE（2）/shV细胞的1.93倍，2.5 mg/L的顺铂对SK-N-BE（2）/shDDX1细胞24 h的抑制率为SK-N-BE（2）/shV细胞的1.38倍。DDX1基因表达降低能显著提高NB细胞对顺铂和多柔比星的药物敏感性。 结论 DDX1的表达受到抑制后，NB细胞侵袭、迁移能力均减弱，NB细胞对多柔比星和顺铂的药物敏感性增加，NB细胞的耐药能力减弱。

猪DDX1基因的克隆、序列分析及表达

根据已知人、小鼠、牛、鸡、犬和恒河猴等物种的DEAD-box解旋酶1(DEAD-box helicase 1,DDX1)基因mRNA序列设计引物,从猪肾传代细胞系(PK-15)中克隆DDX1基因编码区(CDs)序列,对该基因进行生物信息学分析、组织表达谱分析。进一步将猪DDX1基因CDs序列克隆至真核表达载体pCMV-Tag2B,构建的重组真核表达质粒转染PK-15细胞后运用Western blot和间接免疫荧光试验检测DDX1基因的真核表达。结果显示:成功克隆了猪DDX1基因的cDNA序列(GenBank登录号为KU522467),其开放读码框全长为2 223bp,编码740个氨基酸;与牛、鸡、黑猩猩、犬、人、小鼠、大鼠和恒河猴的氨基酸序列同源性分别为98.8%、93.5%、97.6%、98.8%、97.7%、97.0%、97.6%和97.8%。表达谱分析表明,猪DDX1mRNA在不同组织中的表达水平存在差异,表现为脂肪、肝脏和脾脏中高表达,而在胃、心脏和肌肉中表达较低。成功构建了猪DDX1基因真核表达质粒,经证实目的基因可以在真核细胞中特异性表达,且表达的DDX1蛋白主要定位于细胞质中,少量定位于细胞核中。结果表明:本试验克隆了猪DDX1基因的序列,分析了其在不同组织的表达规律,并构建了DDX1基因重组表达质粒,为该基因下一步的功能学研究奠定了基础。