丹皮酚对β-1,3-葡聚糖诱导的小鼠巨噬细胞Dectin-1/NLRP3信号通路抑制作用研究

目的:研究丹皮酚对β-1,3-葡聚糖诱导的巨噬细胞上Dectin-1/NLRP3信号通路的影响。 方法:培养小鼠RAW264.7巨噬细胞,并分成空白对照组、β-1,3-葡聚糖诱导模型组、昆布多糖组和丹皮酚组,β-1,3-葡聚糖诱导巨噬细胞24 h建立ALD炎症模型。通过MTT法检测细胞活性,通过倒置显微镜观察各组形态学变化,通过Western blot检测小鼠RAW264.7巨噬细胞Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1蛋白的表达,通过RT-qPCR检测小鼠RAW264.7巨噬细胞Dectin-1、NLRP3、caspase-1 mRNA的表达,通过ELISA检测各组培养液中IL-1β、IL-18的分泌水平。结果:MTT结果表明,与空白对照组相比,β-1,3-葡聚糖诱导模型组抑制细胞增殖活性减弱。与β-1,3-葡聚糖诱导模型组相比,丹皮酚干预后细胞增殖活性增强。形态学观察发现,空白对照组细胞体积小,形态圆润。β-1,3-葡聚糖诱导后细胞体积变大,分化严重,形态狭长。丹皮酚干预后细胞分化减轻,细胞形态近似圆形。Western blot、RT-qPCR和ELISA结果表明,与空白对照组相比,β-1,3-葡聚糖能显著升高巨噬细胞中Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1的蛋白表达水平和Dectin-1、NLRP3、caspase-1 mRNA表达水平以及细胞上清液IL-1β、IL-18的分泌水平。而与β-1,3-葡聚糖诱导模型组相比,经丹皮酚干预后可明显降低巨噬细胞中 Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1的蛋白表达水平和Dectin-1、NLRP3、caspase-1 mRNA表达水平以及细胞上清液IL-1β、IL-18的分泌水平。结论:本研究结果表明丹皮酚可能通过抑制β-1,3-葡聚糖诱导的Dectin-1/NLRP3信号通路上Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1的过表达从而有效降低终末炎症因子IL-1β及IL-18的释放,进而有效抑制β-1,3-葡聚糖诱导的ALD炎症反应。

健脾益肠散对溃疡性结肠炎大鼠NLRP3信号通路IL-1β、IL-18表达的影响

目的探讨健脾益肠散对溃疡性结肠炎(UC)模型大鼠NLRP3信号通路白细胞介素(IL)-1β、IL-18表达的影响。方法从40只SD大鼠随机选取10只作为正常组,其余大鼠自由饮用5%硫酸葡聚糖溶液7 d制备UC大鼠模型,将成模大鼠随机分为模型组、柳氮磺吡啶组和健脾益肠散组,每组10只。健脾益肠散组和柳氮磺吡啶组予相应药液灌胃,正常组和模型组予等体积蒸馏水灌胃,连续14 d。观察大鼠一般状况,并进行疾病活动指数(DAI)评分,ELISA检测大鼠血清核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、胱天蛋白酶1(Caspase-l)含量,免疫组化染色、Western blot和RT-PCR检测结肠组织IL-1β、IL-18蛋白及mRNA表达。结果与正常组比较,模型组大鼠一般状况较差,DAI评分显著升高(P<0.01),血清NLRP3、ASC、Caspase-l含量显著增加(P<0.01),结肠组织IL-1β、IL-18蛋白和mRNA表达均显著升高(P<0.01);与模型组比较,健脾益肠散组和柳氮磺嘧啶组大鼠一般状况明显好转,DAI评分显著降低(P<0.01),血清NLRP3、ASC、Caspase-l含量明显减少(P<0.05,P<0.01),结肠组织IL-1β、IL-18蛋白和mRNA表达均明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论健脾益肠散可抑制NLRP3信号通路IL-1β、IL-18表达,改善结肠免疫炎症损伤,发挥治疗UC作用。

芩百清肺浓缩丸对感染后咳嗽大鼠NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路的影响

目的:探讨芩百清肺浓缩丸(芩百)对感染后咳嗽(PIC)大鼠NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1/白细胞介素1β(NLRP3/Caspase-1/IL-1β)信号通路的调节作用。方法:40只SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组(阿斯美)及芩百清肺浓缩丸(芩百)组,每组10只。采用烟熏联合LPS滴鼻法及辣椒素雾化吸入法构建PIC模型。于造模后第18天开始灌胃给药,芩百组给予芩百清肺浓缩丸水溶液1.65 g/kg,阳性对照组给予阿斯美25.11 mg/kg,每日1次,连续给药10 d。末次干预后,ELISA检测BALF中IL-1β含量,、Western blot检测肺组织NLRP3、Caspase-1蛋白表达。结果:与正常组相比,模型组BALF中IL-1β含量以及肺组织NLRP3、Caspase-1蛋白表达均显著升高(P<0.05);与模型组相比,阳性对照组和芩百组上述指标均显著降低(P<0.05);芩百组BALF中IL-1β水平和肺组织NLRP3蛋白表达均显著低于阳性对照组(P<0.05)。结论:芩百清肺浓缩丸能够显著减轻PIC大鼠的气道炎症和气道高反应性,其作用机制可能与抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路有关。

大黄蛰虫丸调节IL-1β/NF-κB/NLRP3信号通路对动脉粥样硬化大鼠主动脉炎性损伤的影响

目的 探讨大黄蛰虫丸调节IL-1β/NF-κB/NLRP3信号通路对动脉粥样硬化(AS)大鼠主动脉炎性损伤的影响。方法 将40只大鼠分为正常对照组(NS)、模型组、地奥心血康干预组(阳性组)及大黄蛰虫丸干预组(大黄蛰虫丸组),每组各10只。除正常组外,余下3组小鼠均构建AS模型。应用油红染色对主动脉病理切片情况进行观察,采用EILSA法检测血清脂质水平[甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)]、血清炎症指标(IL-6、IL-1β、TNF-α水平);应用流式细胞术对外周血Th17/Treg细胞水平进行检测,并通过RT-qPCR法和Western blot分别检测IL-1β/NF-κB/NLRP3信号通路mRNA和蛋白表达水平,并计算AI指数。结果 除NC组大鼠以外,其他各组大鼠动脉组织中均出现内膜增厚、斑块沉积和不连续、大量炎症细胞浸润等现象;其中模型组动脉组织损伤现象最为显著,阳性组和大黄蛰虫丸组较模型组明显改善,动脉组织结构情况与NC组相近。模型组血清TC[(9.82±1.46)mmol/L]、TG[(9.82±1.46)mmol/L]、LDL-C[(2.93±0.22)mmol/L]、IL-6[(97.65±9.11)ng/L]、TNF-α[(93.21±11.17)ng/L]水平及外周血Th17[(3.56±0.34)%]、Treg细胞[(4.41±0.38)%]水平高于NC组[分别为(3.71±0.57)mmol/L、(6.47±0.92)mmol/L、(0.94±0.15)mmol/L、(16.52±2.76)ng/L、(5.45±0.84)ng/L、(1.83±0.16)%、(7.72±0.73)%](均P<0.05),HDL-C水平[(2.92±0.31)mmol/L]低于NC组[(0.95±0.08)mmol/L](P<0.05);与模型组相比,大黄蜇虫丸组和阳性组血清TC[分别为(3.92±0.72)mmol/L、(3.71±0.65)mmol/L]、TG[分别为(6.71±0.83)mmol/L、(6.83±0.72)mmol/L]、LDL-C[分别为(1.15±0.11)mmol/L、(1.11±0.13)mmol/L]、IL-6[分别为(19.83±2.55)ng/L、(18.51±3.72)ng/L]、TNF-α[分别为(17.08±1.72)ng/L、(15.92±1.56)ng/L]水平及外周血Th17[分别为(2.11±0.25)%、(2.06±0.22)%]、Treg细胞[分别为(7.45±0.76)%、(7.31±0.72)%]水平偏低,HDL-C偏高[分别为(2.18±0.72)mmol/L、(2.23±0.61)mmol/L],趋近于NC组(均P<0.05)。与NC组AI指数(0.35±0.08)比较,模型组、阳性组和大黄蛰虫丸组(分别为9.71±2.04、1.21±0.15、0.83±0.17)均明显升高(均P<0.05),其中阳性组和大黄蛰虫丸组AI指数低于模型组(均P<0.05)。模型组大鼠的IL-6、TNF-α水平和外周血IL-1β、NF-κB、NLRP3 mRNA和信号通路蛋白表达水平均较NC组、阳性组和大黄蛰虫组明显偏高(均P<0.05)。结论 大黄蛰虫丸对动脉粥样硬化大鼠主动脉的炎性损伤可能具有明显的改善作用,可能是通过抑制IL-1β/NF-κB/NLRP3信号通路来实现治疗效果。

宣肺败毒方调控TLR4/NLRP3/Caspase1信号通路抗小鼠急性肺损伤的作用机制研究

[目的]基于Toll样受体4(TLR4)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)/半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase1)信号通路研究宣肺败毒方(XFBD)对IgG免疫复合物(IgG-IC)诱导小鼠急性肺损伤(ALI)的药效作用及机制研究。[方法]采用IgG-IC诱导小鼠构建ALI模型,灌胃XFBD 4 g生药/kg和8 g生药/kg,单次给药;苏木素-伊红染色法(HE)观察肺组织病理变化;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒测定细胞活力;荧光定量PCR法检测小鼠肺组织细胞因子白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-1β(IL-1β)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)以及TLR4/NLRP3/Caspase1信号通路相关因子mRNA表达量;免疫组化法检测小鼠肺组织TLR4、NLRP3和消皮素D(GSDMD)蛋白表达;蛋白免疫印迹法检测小鼠肺组织闭合蛋白(Occludin)、闭锁连接蛋白1(ZO-1)以及TLR4/NLRP3/Caspase1信号通路相关因子蛋白表达水平。[结果]与正常组相比,模型组小鼠肺组织炎性细胞浸润,肺泡间隙增厚,肺组织病理损伤评分和肺组织脏器系数显著升高,LDH及细胞因子表达明显升高,Occludin和ZO-1表达下调,TLR4/NLRP3/Caspase1信号通路相关因子mRNA和蛋白水平显著升高;与模型组相比,XFBD显著缓解急性肺损伤小鼠肺组织炎症细胞浸润,降低细胞因子表达,上调Occludin和ZO-1,显著下调TLR4/NLRP3/Caspase1信号通路相关因子mRNA和蛋白水平。[结论]XFBD可通过调控TLR4/NLRP3/Caspase1信号通路发挥抗小鼠ALI的作用。

紫草素调节HIF-1α/NLRP3信号通路对蛛网膜下腔出血大鼠神经功能损伤的影响

目的探究紫草素调节缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)/NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)信号通路对蛛网膜下腔出血(SAH)大鼠神经功能损伤的影响。方法大鼠随机分为假手术组、模型组、YC-1(HIF-1α抑制剂,5 mg/kg)组、紫草素低剂量组(4 mg/kg)、紫草素高剂量组(25 mg/kg)、紫草素高剂量(25 mg/kg)+AG1(HIF-1α激活剂,10 mg/kg)组,每组15只。采用颈内动脉刺破法制备SAH模型。采用Zea-Longa评分法评估6组大鼠神经功能;ELISA法检测血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和IL-1β水平;HE染色观察大鼠海马组织形态学变化,TUNEL染色法检测海马神经元凋亡率;伊文思蓝染色检测血脑屏障通透性;商品化试剂盒检测大鼠脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(MDA)、丙二醛(CAT)水平,Western blot检测大鼠脑组织Bax、Bcl-2、HIF-1α、NLRP3蛋白表达。结果假手术组大鼠海马神经元形态结构正常;与假手术组相比,模型组大鼠海马神经元有大量水肿、结构模糊,有细胞核溶解,变型固缩,部分细胞核消失,大鼠神经功能评分、血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平、海马神经元凋亡率、伊文思蓝渗出量、脑组织MDA水平、Bax、HIF-1α、NLRP3水平显著增加,脑组织SOD、CAT水平、Bcl-2蛋白水平显著降低(P<0.05);与模型组比较,紫草素低剂量组、紫草素高剂量组和YC-1组鼠海马神经元病理损伤显著改善,大鼠神经功能评分、血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平、海马神经元凋亡率、伊文思蓝渗出量、脑组织MDA水平、Bax、HIF-1α、NLRP3水平显著降低,SOD、CAT水平、Bcl-2蛋白水平显著升高(P<0.05);与紫草素高剂量组比较,紫草素高剂量+AG1组大鼠海马神经元病理损伤显著加重,大鼠神经功能评分、血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平、海马神经元凋亡率、伊文思蓝渗出量、脑组织MDA水平、Bax、HIF-1α、NLRP3水平显著增加,SOD、CAT水平、Bcl-2蛋白水平显著降低(P<0.05)。结论紫草素抑制HIF-1α/NLRP3信号通路以降低氧化应激和炎性反应,进而改善SAH大鼠神经功能损伤。

风咳汤通过SIRT1/NF-κB/NLRP3信号通路减轻咳嗽变异性哮喘大鼠气道炎症

目的探讨风咳汤对咳嗽变异性哮喘(CVA)大鼠气道炎症及肺功能的改善作用及机制。方法采用卵蛋白(OVA)和氢氧化铝混合物1 mL皮下注射致敏后再以雾化的OVA激发哮喘建立CVA大鼠模型,分别给予风咳汤低剂量、高剂量和地塞米松进行治疗,正常对照组与模型组灌胃相应体积生理盐水。Diff-Quick法进行肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞计数,ELISA法检测各组大鼠BALF上清液中白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-17(IL-17)、白细胞介素-22(IL-22)含量;观察大鼠肺组织病理学变化;检测大鼠肺组织中SIRT1/NF-κB/NLRP3信号通路中的相关蛋白和基因表达水平;检测肝组织中Caspase-1的活性。结果与正常组比较,模型组大鼠炎症细胞数量、炎症因子含量和HE染色显示的病理改变都显著升高,SIRT1表达水平下降,NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白水平和mRNA水平显著升高(P<0.05)。与模型组相比,风咳汤高剂量可以显著降低炎症细胞数和炎症因子含量,改善肺组织的病理改变,升高SIRT1的表达水平同时降低NF-κB、NLRP3、ASC和IL-1β的蛋白水平及mRNA水平,其作用与地塞米松相当。此外,风咳汤还可以降低Caspase-1的活性。结论风咳汤可以通过SIRT1/NF-κB/NLRP3信号通路有效改善CVA大鼠气道炎症,改善肺功能。

基于NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路探讨苓桂气化方改善射血分数保留心力衰竭早期舒张功能的分子机制

目的观察苓桂气化方对射血分数保留心力衰竭(heart failure with preserved ejection fraction,HFpEF)早期模型大鼠心脏舒张功能的干预效应,基于核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)/胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1(cysteine-containing aspartate-specific proteases-1,Caspase-1)/消皮素D(Gasdermin D,GSDMD)通路探讨其潜在的分子作用机制。方法40只自发性高血压大鼠高盐高脂高糖饮食联合腹腔注射链脲佐菌素溶液建立HFpEF早期大鼠模型,分为HFpEF组、恩格列净组(1.8 mg/kg)、苓桂气化方低剂量组(4.96 g/kg)、苓桂气化方高剂量组(9.92 g/kg),予相应药物灌胃;正常血压组、空白组予等剂量生理盐水灌胃,连续干预9周。采用超声心动图检测大鼠左心房内径(left atrial diameter,LAD)、舒张早期二尖瓣血流速度(left ventricular early diastolic filling peak velocity,E)与舒张晚期二尖瓣血流速度(atrial systolic left ventricular filling peak velocity,A)比值、左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF);酶联免疫吸附测定法检测血清心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)含量;苏木精—伊红染色观察心肌组织病理变化;蛋白质印迹(Western Blot,WB)法检测NLRP3、Caspase-1、GSDMD和白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)的表达。结果与正常血压组相比,HFpEF组LAD和E/A增加(P<0.05),LVEF无明显变化(P>0.05);血清ANP含量升高(P<0.05);病理观察显示心肌炎症浸润;WB结果示NLRP3、Caspase-1、GSDMD和IL-1β蛋白含量升高(P<0.05),表明建模成功。与HFpEF组比,恩格列净组和苓桂气化方低、高剂量组的LAD和E/A减小(P<0.05),血清ANP含量降低(P<0.05),病理观察显示心肌炎症浸润减轻,WB结果示恩格列净组NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白含量降低(P<0.05),苓桂气化方低剂量组NLRP3、IL-1β蛋白含量降低(P<0.05),苓桂气化方高剂量组NLRP3、GSDMD、IL-1β蛋白含量降低(P<0.05),其余蛋白含量有下降趋势。结论苓桂气化方能改善HFpEF早期模型大鼠心脏舒张功能,其机制可能与调控NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路、减轻心肌炎症浸润、抑制心房重构相关。

基于NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路探讨针灸预防应激性胃溃疡细胞焦亡的作用机制

目的:观察针刺与艾灸对应激性胃溃疡模型大鼠的防治作用及其对模型大鼠胃黏膜NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)/消皮素D(GSDMD)细胞焦亡通路的干预作用,探索其作用机制。方法:将SD大鼠随机分为正常组、模型组、预灸组和预针刺组。预灸组和预针刺组大鼠分别予艾灸、针刺中脘、足三里,每穴刺激20 min,连续7 d;正常组、模型组大鼠仅予艾灸支架固定。除正常组外,其余各组大鼠采用无水乙醇与阿司匹林混悬液灌胃制备应激性胃溃疡模型。造模结束后次日,各组大鼠麻醉后取血分离血清,取胃黏膜组织。评估胃黏膜损伤指数(UI),苏木精-伊红(HE)染色法观察胃黏膜组织的病理形态变化,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-18水平,蛋白质免疫印迹(Western blot)法分析胃黏膜组织NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表达。结果:模型组大鼠UI值明显高于正常组(P<0.01),胃黏膜组织明显损伤,存在出血灶,病理显示大量红细胞渗出;预灸组和预针刺组大鼠UI值均明显低于模型组(P<0.01),其中预灸组UI值明显低于预针刺组(P<0.05);预灸组和预针刺组胃黏膜组织表面只有少量出血灶,病理显示胃黏膜大体完整,有少量红细胞渗出,其中预灸组胃黏膜病变程度更轻。模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18水平均明显高于正常组(P<0.01);预灸组和预针刺组上述指标水平均明显低于模型组(P<0.05,P<0.01),其中预灸组上述指标水平均明显低于预针刺组(P<0.05,P<0.01)。模型组大鼠胃黏膜组织NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表达水平均显著高于正常组(P<0.05);预灸组和预针刺组上述蛋白表达水平均明显低于模型组(P<0.05),其中预灸组Caspase-1蛋白表达水平明显低于预针刺组(P<0.05)。结论:针刺与艾灸均可以预防应激性胃溃疡胃黏膜损伤,其可能通过调控胃黏膜组织中NLRP3/Caspase-1/GSDMD细胞焦亡通路蛋白表达水平,缓解胃黏膜炎症反应,其中艾灸预处理对炎症因子的改善更具优势。

基于NLRP3/caspase-1/GSDMD信号通路探讨双硫仑改善HFpEF大鼠心功能的机制

目的:探讨双硫仑(DSF)在高脂饮食(HFD)和一氧化氮阻滞剂Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME诱导的射血分数保留的心力衰竭(HFpEF)大鼠模型中的作用及可能的机制。方法:通过HFD+L-NAME构建HFpEF大鼠模型;将SD大鼠随机分为三组:control组(给予正常饮食和水喂养)、HFpEF组(给予HFD和含0.5 g/L L-NAME的饮用水喂养)和DSF+HFpEF组(在HFD+L-NAME的基础上给予DSF治疗)。5周后,使用超声心动图和运动力竭实验检测心功能;苏木素-伊红和麦胚凝集素染色检测心肌病理改变;Masson染色检测心肌纤维化程度;TUNEL染色观察细胞凋亡水平;Western blot检测心肌中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、cleaved caspase-1和消皮素D的N端片段(GSDMD-N)蛋白水平;ELISA检测血清N末端脑利尿钠肽前体(NT-proBNP)水平及心肌中白细胞介素1β(IL-1β)和IL-18含量。结果:与control组相比,HFpEF组大鼠体重、收缩压、舒张压、E/E'比值、舒张期左心室前壁厚度(LVAWd)和血清NT-proBNP水平均显著升高(P<0.05),E/A比值和整体纵向应变(GLS)绝对值均显著降低(P<0.05);与HFpEF组相比,DSF+HFpEF组大鼠体重、E/E'比值、舒张压和血清NTproBNP水平均显著降低(P<0.05),E/A比值和GLS绝对值显著升高(P<0.05),收缩压、舒张期左心室后壁厚度(LVPWd)和左心室射血分数(LVEF)无显著改变(P>0.05)。与control组相比,HFpEF组大鼠心肌纤维化面积、心肌细胞横截面积和凋亡率均显著升高(P<0.05),DSF+HFpEF组大鼠上述指标均显著下降(P<0.05)。Western blot和ELISA结果显示,与control组相比,HFpEF组大鼠心肌中NLRP3、cleaved caspase-1和GSDMD-N蛋白水平及炎症因子IL-1β和IL-18含量均显著升高(P<0.05);与HFpEF组相比,DSF+HFpEF组大鼠上述指标均显著下降(P<0.05)。结论:DSF可改善HFpEF大鼠心功能,抑制心肌重构,其机制可能与抑制NLRP3/caspase-1/GSDMD信号通路、减轻心肌炎症反应有关。

益母草碱调节IRE1α/TXNIP/NLRP3信号通路对急性呼吸窘迫综合征大鼠炎症反应的影响

目的探究益母草碱调节IRE1α/TXNIP/NLRP3信号通路对急性呼吸窘迫综合征(ARDS)大鼠炎症反应的影响。方法将大鼠随机分为空白组、模型组、益母草碱低剂量组、益母草碱高剂量组、联用HY-N2485组(高剂量益母草碱+NLRP3激活剂)。检测大鼠肺功能;血气分析仪检测氧分压(PaO_(2))和二氧化碳分压(PaCO_(2));ELISA法检测肺泡灌洗液白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;检测肺组织干湿比;检测肺组织丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性;HE染色观察大鼠肺组织病理形态;Western blotting检测肺组织中IRE1α、TXNIP、NLRP3、Caspase-1、Cleaved Caspase-3蛋白表达。结果与空白组相比,模型组肺组织形态有明显损伤,PEF、FVC和FEV0.3/FVC水平、PaO_(2)、OI水平、肺泡灌洗液IL-10水平、肺组织CAT和SOD活性降低,PaCO_(2)水平、肺泡灌洗液IL-1β、IL-6、TNF-α水平、肺组织病理评分、肺组织MDA含量、IRE1α、TXNIP、NLRP3、Caspase-1、Cleaved Caspase-3蛋白表达水平升高(P<0.05);与模型组相比,益母草碱低、高剂量组大鼠肺组织损伤明显减轻,PEF、FVC和FEV0.3/FVC水平、PaO_(2)、OI水平、肺泡灌洗液IL-10水平、肺组织CAT和SOD活性升高,PaCO_(2)水平、肺泡灌洗液IL-1β、IL-6、TNF-α水平、肺组织病理学评分、肺组织MDA含量、IRE1α、TXNIP、NLRP3、Caspase-1、Cleaved Caspase-3蛋白表达水平降低(P<0.05);HY-N2485可减弱益母草碱对ARDS大鼠的改善作用(P<0.05)。结论益母草碱可降低ARDS大鼠炎症和氧化应激,减轻肺组织损伤,改善肺功能,可能与抑制IRE1α/TXNIP/NLRP3信号通路有关。

基于NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路探讨芍药苷对雄性大鼠急性辐射诱导的心脏损伤的作用和机制

目的基于NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路探讨芍药苷(PF)对雄性大鼠急性辐射诱导的心脏损伤的作用和机制。方法将雄性Wistar大鼠随机分为空白对照组(Con组)、单纯照射20Gy组(Mod组)和芍药苷低剂量+20Gy照射组(L组)、芍药苷中剂量+20Gy照射组(M组)、PF高剂量+20Gy照射组(H组)。采用6 MV X线经心前区照射(单次20 Gy)制作心肌损伤模型。PF组自照射前7 d开始至照射后7 d,隔天灌胃(芍药苷低剂量组为25.0 mg/kg、中剂量组为50.0 mg/kg、高剂量组为75.0 mg/kg),Con组和Mod组以同样方式予生理盐水。用ELISA法检测血清中的IL-1β、IL-18表达水平;用HE染色法观察心肌组织的病理损伤情况;用WB法和IHC法检测心肌组织中的NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白表达水平。结果与Con组相比,Mod组血清中的IL-1β、IL-18表达水平明显升高(P<0.05)。与Mod组比,PF组血清中的IL-1β、IL-18表达水平降低;与Con组比,Mod组的心肌细胞广泛大片状坏死、断裂,排列紊乱,心肌间质有大量炎性细胞浸润,横纹肌消失;与Mod组比,随着PF剂量升高,细胞逐渐恢复正常,排列整齐,心肌炎性细胞浸润减轻;与Con组相比,PF组心肌组织中的NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β表达水平明显升高(P<0.05);与Mod组比,随着PF剂量升高,Mod组心肌组织中的NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β表达水平降低。结论芍药苷可减少辐射诱导的心肌损伤引起的心肌炎症及心肌细胞焦亡,起到心肌保护作用。NLRP3炎症小体可作为辐射诱导的心肌损伤潜在治疗靶点。

瑞马唑仑调节NLRP3/caspase-1/GSDMD信号通路对LPS诱导的神经元焦亡的影响

目的 探讨瑞马唑仑(REM)调节Nod样受体蛋白3(NLRP3)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)/消皮素D(GSDMD)信号通路对脂多糖(LPS)诱导的神经元焦亡的影响。方法 将对数期小鼠海马神经元HT22细胞随机分为正常对照组(Ctrl组)、LPS诱导组(LPS组,10 mg/L LPS)、低浓度REM组(REM-低组,160μmol/L REM)、高浓度REM组(REM-高组,320μmol/L REM)和REM-高+NLRP3激活剂尼日利亚菌素组(REM-高+尼日利亚菌素组,320μmol/L REM+10μmol/L尼日利亚菌素)。除Ctrl组外,其余各组HT22细胞均使用LPS进行诱导。各组加药处理后,采用细胞计数试剂盒8测定HT22细胞的吸光度(A值)。采用Hoechst33342/碘化吡啶(PI)染色检测HT22细胞焦亡率。采用酶联免疫吸附试验检测HT22细胞上清液中白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测HT22细胞中NLRP3信使RNA(mRNA)、Caspase-1 mRNA、GSDMD mRNA表达水平。采用蛋白质印迹法检测HT22细胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD和凋亡相关斑点样蛋白(ASC)表达水平。结果 LPS组HT22细胞48、72 h的A_(450)值显著低于Ctrl组(P<0.05),而细胞焦亡率、上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平,以及NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA和蛋白表达水平、ASC蛋白表达水平均显著高于Ctrl组(P<0.05)。REM-低组和REM-高组HT22细胞48、72 h的A_(450)值显著高于LPS组,且REM-高组高于REM-低组,差异均有统计学意义(P<0.05),而REM-低组和REM-高组HT22细胞焦亡率、上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平,以及NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA和蛋白表达水平、ASC蛋白表达水平显著低于LPS组,且REM-高组低于REM-低组,差异均有统计学意义(P<0.05)。REM-高+尼日利亚菌素组HT22细胞48、72 h的A_(450)值显著低于REM-高组(P<0.05),而细胞焦亡率、上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平,以及NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA和蛋白表达水平、ASC蛋白表达水平均显著高于REM-高组(P<0.05)。结论 REM可能通过下调NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路减轻LPS诱导的神经元焦亡。

E.coli HPI通过NLRP3/caspase-1信号通路诱导细胞焦亡而促进肠道炎症

目的:探究大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)强毒力岛(high-pathogenicity island,HPI)对细胞焦亡及肠道炎症的影响。方法:用含HPI的E.coli株(HPI+)、HPI缺失的E.coli株(△HPI)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)分别处理昆明小鼠和IPEC-J2细胞(猪小肠上皮细胞)。测定小鼠肠道乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、IgA表达和分泌性IgA(secretory IgA,SIgA)含量;HE和TUNEL染色观察肠道损伤;RT-qPCR、免疫组织化学染色和Western blot检测小鼠肠组织和IPEC-J2细胞中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)/caspase-1信号通路关键调控点的表达;ELISA检测小鼠血清和IPEC-J2细胞培养上清液中白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和IL-18含量;共聚焦显微镜观察NLRP3与caspase-1的共定位。siRNA沉默IPEC-J2细胞的NLRP3,验证NLRP3在E.coli HPI感染中的关键调控功能。结果:相对于△HPI感染,E.coli HPI显著降低小鼠肠道SOD活性,增加IgA+B细胞,并促进LDH的释放和SIgA的分泌;ELISA、HE染色和TUNEL染色结果显示,E.coli HPI促进了小鼠肠道上皮细胞DNA断裂、组织损伤和炎症;Western blot结果显示,相对于△HPI,E.coli HPI感染使得小鼠肠道消皮素D的N端片段(gasdermin D N-terminal fragment,GSDMD-N)蛋白水平显著升高;RT-qPCR和免疫组织化学染色结果显示,E.coli HPI显著促进了小鼠肠道和IPEC-J2细胞中NLRP3、含caspase募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain,ASC)、caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18的mRNA和蛋白表达,IL-1β和IL-18分泌增加;共聚焦显微镜观察发现,相对于△HPI感染,E.coli HPI显著促进了NLRP3炎症小体的组装,使得NLRP3与caspase-1发生共定位;此外,在NLRP3沉默的IPEC-J2细胞中观察到E.coli HPI诱导的细胞炎症、细胞损伤及NLRP3/caspase-1信号通路的激活被缓解。结论:HPI的存在增强了E.coli的毒力水平,促进肠道炎症;NLRP3/caspase-1信号通路调控的细胞焦亡参与了E.coli HPI诱导的肠道损伤。

桑色素抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡上皮细胞焦亡的影响

目的:探讨桑色素(MH)抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)/半胱氨酸天冬氨酸酶-1(Caspase-1)/IL-1β信号通路对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺泡上皮细胞焦亡的作用机制。方法:采用烟熏法建立COPD模型大鼠,将其随机分模型组(COPD组)、MH低、中、高剂量组(MH-L、MH-M、MH-H组)(50、100、200 mg/kg)、阳性对照组(地塞米松组,DXMS,0.09 mg/kg),另取10只健康大鼠作为正常对照组(NC组)。检测大鼠肺功能指标[潮气量(TV)、肺活量(FVC)和呼气峰流速(PEF)];HE染色观察肺组织病理学变化;免疫荧光双染观察肺泡上皮细胞焦亡情况;ELISA检测肺泡灌洗液(BALF)中炎症因子水平;RT-qPCR检测NLRP3、Caspase-1、消皮素D(GSDMD)、IL-1βmRNA水平;Western blot检测肺组织SP-C、NLRP3、C-Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N、IL-1β蛋白表达。结果:与COPD组比较,DXMS组、MH各组肺组织管腔狭窄、黏液分泌和支气管黏膜上皮细胞坏死等病理学变化明显改善,肺功能指标(TV、FVC、PEF)显著上升(P<0.05),且MH-L、MH-M、MH-H组依次上升(P<0.05);TNF-α、IL-6、IL-8水平、NLRP3及C-Caspase-1免疫荧光表达、NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1βmRNA水平、NLRP3、C-Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N、IL-1β蛋白水平显著下降,SP-C蛋白表达逐渐上升(P<0.05)。结论:MH可抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路及其介导的炎症因子释放和细胞焦亡,减轻COPD大鼠的肺组织病变。

基于Gal-3/NLRP3/IL-1β信号通路探讨异荭草苷治疗溃疡性结肠炎的作用机制

目的探讨异荭草苷对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结肠炎(UC)小鼠的治疗效果及其作用机制。方法将48只C57BL/6J小鼠随机分为正常组、模型组、美沙拉嗪组(600 mg·kg^(-1))、异荭草苷低剂量组(25 mg·kg^(-1))、异荭草苷高剂量组(50 mg·kg^(-1))及异荭草苷对照组(50 mg·kg^(-1)),每组8只。小鼠自由饮用2%DSS溶液复制UC模型,实验进行3周后,各给药组给予相应药物灌胃治疗4周。给药结束后,称取体质量,摘眼球取血,剖取结肠组织。采用苏木素-伊红(HE)、阿利新蓝-过碘酸-雪夫染色(AB-PAS)法观察小鼠结肠组织病理形态变化;透射电子显微镜观察小鼠结肠组织超微结构;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清白细胞介素(IL)-6、IL-8、IL-10、IL-1β、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、脂多糖(LPS)和髓过氧化物酶(MPO)水平;免疫组化法检测小鼠结肠组织中半乳糖凝集素(Gal-3)蛋白表达;免疫荧光法检测黏蛋白(MUC2)表达及NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)和凋亡相关斑点样蛋白(ASC)共定位情况;免疫印迹(Western Blot)法检测小鼠结肠组织中Gal-3、NLRP3、ASC、半胱氨酸蛋白酶1(Caspase-1)、IL-1β、IL-18、闭合蛋白(Occludin)、闭锁小带蛋白1(ZO-1)蛋白表达。结果与正常组比较,模型组小鼠体质量明显下降,结肠长度明显缩短,肠质量指数明显增加(P<0.01);小鼠肠黏膜结构紊乱,微绒毛稀疏,隐窝结构见大量炎性细胞浸润,线粒体肿胀明显,杯状细胞明显减少;血清IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α、LPS和MPO水平明显升高,IL-10水平明显降低(P<0.01);结肠组织MUC2蛋白阳性表达减少及NLRP3和ASC共定位增强;结肠组织中Gal-3、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表达明显增加,Occludin和ZO-1蛋白表达明显降低(P<0.01)。与模型组比较,异荭草苷低、高剂量组小鼠体质量明显上升,结肠长度明显增长,肠质量指数明显降低(P<0.05,P<0.01);肠黏膜、微绒毛及线粒体结构明显恢复,炎性浸润减轻,杯状细胞明显增加;血清IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α、LPS和MPO水平明显降低,IL-10水平明显升高(P<0.05,P<0.01);结肠组织MUC2蛋白阳性表达增加,NLRP3和ASC共定位减弱;结肠组织中Gal-3、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表达明显降低,Occludin和ZO-1蛋白表达明显增加(P<0.05,P<0.01)。结论异荭草苷对DSS诱导的UC小鼠具有良好的治疗效果,其机制可能与抑制Gal-3/NLRP3/IL-1β信号通路,保护肠黏膜屏障有关。

金雀异黄素通过调控TGF-β1/Smad3信号通路对2型糖尿病大鼠心肌纤维化的影响

目的 探讨金雀异黄素减轻糖尿病大鼠心肌纤维化的作用及潜在机制。方法 通过高脂饮食结合腹腔注射链脲菌素(STZ)法建立大鼠2型糖尿病(T2DM)模型,并随机分为模型组、二甲双胍组(100 mg/kg)及金雀异黄素低、高剂量组(50、100 mg/kg),另设正常组给予常规饮食,每组10只。各给药组灌胃给药8周,检测体质量、心功能、心脏质量及心脏指数,血清CK-MB、AST及LDH活性,观察心肌纤维化程度,心肌组织转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad同源物3(Smad3)mRNA和蛋白表达,心肌组织Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)和Ⅲ型胶原(CollagenⅢ)蛋白分布及表达。结果 与模型组比较,金雀异黄素各剂量组大鼠体质量、每搏输出量(SV)及射血分数(EF)升高(P<0.01),心脏指数、左心室收缩末期内径(LVIDs)、血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)活性降低(P<0.05,P<0.01),心肌组织胶原相对面积及CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表达均降低(P<0.05,P<0.01),心肌组织TGF-β1、Smad3 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),金雀异黄素高剂量组左心室舒张末期内径(LVIDd)降低(P<0.05)。结论 金雀异黄素可通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路,减轻2型糖尿病大鼠心肌纤维化作用,进而发挥保护心脏效应。

杨梅素调节NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路对肺炎链球菌诱导肺泡上皮细胞焦亡的影响

目的探讨杨梅素(myricetin,MYR)调节NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain,leucine-rich repeat and pyrin domain-containing 3,NLRP3)/半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)/白细胞介素-1β(IL-1β)信号通路对肺炎链球菌诱导肺泡上皮细胞焦亡的影响。方法将人II型肺泡上皮细胞(human type II alveolar epithelial cells,AT II)随机分为5组:对照组、模型组、L-MYR组(20μg/mL)、M-MYR组(40μg/mL)、H-MYR组(80μg/mL)、ATP组(80μg/mL MYR+2 mmol/L NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路激活剂ATP),且除对照组正常培养,其余各组以肺炎链球菌感染建立损伤模型。采用MTT和平板克隆实验检测细胞增殖;TUNEL检测细胞焦亡;ELISA检测细胞中白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素18(IL-18)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)水平;Western blotting检测细胞中NLRP3、cleaved caspase-1、焦孔素D(gasdermin D,GSDMD)、IL-1β蛋白表达。结果与对照组相比,模型组细胞的A 490、克隆数降低,细胞焦亡率、IL-1β、IL-18、LDH、NLRP3、cleaved caspase-1、GSDMD、IL-1β表达升高(P<0.05);与模型组相比,L-MYR组、M-MYR组、H-MYR组细胞的A 490、克隆数升高,细胞焦亡率、IL-1β、IL-18、LDH、NLRP3、cleaved caspase-1、GSDMD、IL-1β表达较低(P<0.05);与H-MYR组相比,ATP组细胞的A 490、克隆数降低,细胞焦亡率、IL-1β、IL-18、LDH、NLRP3、cleaved caspase-1、GSDMD、IL-1β表达升高(P<0.05)。结论MYR可能通过抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路,减轻肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞炎症反应,抑制细胞焦亡。

NLRP3/Caspase-1/IL-1β炎症小体通路在小鼠主动脉夹层形成中的作用

目的探讨NLRP3/Caspase-1/IL-1β炎症小体通路在小鼠主动脉夹层形成中的作用及机制。方法50只3周龄雄性C57BL/6小鼠(体质量10~13 g)按随机抽样法分为对照组(n=10,无干预)、β-氨基丙腈(β-aminopropionitrile,BAPN)组[n=20,饮水中加入1 g/(kg·d)BAPN]、BAPN+MCC950组[n=20,饮水中加入1 g/(kg·d)BAPN、腹腔注射NLRP3抑制剂MCC95020 mg/(kg·d)]。记录各组小鼠饮水量、体质量、主动脉夹层发生率、夹层相关病死率。采用HE染色观察主动脉壁炎症浸润;弹力纤维(elastic Van Gieson,EVG)染色观察主动脉壁弹力纤维断裂。采用免疫荧光检测NLRP3、IL-1β、α-SMA、OPN的平均荧光强度。采用Western blot检测NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、α-SMA、OPN表达水平。结果对照组无主动脉夹层发生及死亡,BAPN组主动脉夹层发生率为80%,夹层相关病死率为35%,且主动脉血管壁弹力纤维断裂、明显炎症浸润。与对照组比较,BAPN组中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β蛋白表达增加,收缩型蛋白α-SMA减少而合成型蛋白OPN增加(P<0.05)。而给予NLRP3特异性抑制剂MCC950后,主动脉夹层发生率下降(80%vs 35%,P=0.004),夹层相关病死率下降(35%vs 15%,P=0.144),血管壁弹力纤维断裂、炎症浸润减少;与BAPN组比较,BAPN+MCC950组NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β蛋白表达降低,收缩型蛋白α-SMA表达增加而合成型蛋白OPN表达降低(P<0.05)。结论小鼠主动脉夹层的发生与NLRP3/Caspase-1/IL-1β炎症小体通路活化有关,而NLRP3抑制剂MCC950能减少主动脉夹层发生,具有血管保护作用。

瑞香素调节STING/TBK1/IRF3信号通路对脓毒症大鼠免疫炎症反应的影响

目的探究瑞香素调节STING/TBK1/IRF3信号通路对脓毒症大鼠免疫炎症反应的影响。方法选用80只雄性Sprague Dawley(SD)大鼠,将大鼠随机分为4组,假手术组20只;其余60只按照盲肠结扎穿刺法(CLP)构建脓毒症小鼠模型,腹腔注射不同剂量瑞香素,分为无瑞香素模型组(0 mg/kg)、低剂量组(2.5 mg/kg)、高剂量组(5 mg/kg),每组20只;模型组及假手术组腹腔注射等量0.1%DMSO。观察CLP建模后的各组大鼠存活率。收集肺、肾、肝和脾组织进行病理组织学分析。ELISA检测大鼠血清炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β),流式细胞术检测外周血中的T淋巴细胞亚群,Western blotting检测STING/TBK1/IRF3信号通路蛋白表达变化。结果与假手术组相比,模型组大鼠生存率降低(P<0.05),各个脏器组织损伤明显,血清炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)水平上升(P<0.05),外周血CD4^(+)比例、CD4^(+)/CD8^(+)比值均降低(P<0.05),CD8^(+)比例、Th1/Th2比值均升高(P<0.05),STING、p-TBK1/TBK1、p-IRF3/IRF3蛋白表达均下调(P<0.05)。与模型组相比,瑞香素高剂量组提高了大鼠生存率(P<0.05),各脏器组织损伤明显减轻,血清炎症因子水平降低(P<0.05),外周血CD4^(+)比例、CD4^(+)/CD8^(+)比值升高(P<0.05),CD8^(+)比例、Th1/Th2比值降低(P<0.05),STING、p-TBK1/TBK1、p-IRF3/IRF3蛋白表达升高(P<0.05)。结论瑞香素可通过调节STING/TBK1/IRF3信号通路,改善脓毒症大鼠免疫炎症反应。