鹿筋胶原蛋白提取工艺优化研究

以梅花鹿鹿筋为试材,采用单因素试验和正交试验优化鹿筋胶原蛋白的提取工艺,经过试验获得最佳工艺条件为A_(1)B_(2)C_(2)D_(2),即醋酸浓度为0.5 mol/L,料液比为1∶40 g/mL,浸泡时间为30 h,胃蛋白酶与底物比例为1∶700,在此工艺条件下,鹿筋胶原蛋白回收率可达59%。

高压脉冲电场法提取鹿筋蛋白质和浸膏的工艺研究

目的考察快速提取鹿筋蛋白质和浸膏的最佳工艺。方法用正交试验法,以电场强度、脉冲数、料液比等3项因素设计3个水平进行正交试验。结果鹿筋蛋白质最佳提取工艺为电场强度20 kV/cm,脉冲数8,料液比1:25。鹿筋浸膏最佳提取工艺为电场强度16 kV/cm,脉冲数10,料液比1:25。结论此提取工艺可行,经济、省时、回收率高。

鹿筋胶原蛋白提取条件优化

为对鹿筋胶原蛋白提取条件进行优化,该试验采用单因素分析及正交试验筛选出鹿筋胶原蛋白提取条件,以及提取产物对体外培养MC3T3成骨细胞的增殖作用。结果表明:最佳提取条件为醋酸体积分数5%,浸泡时间48 h,煎煮时间1.5 h,胃蛋白酶用量1∶1000,酶解时间6 h,鹿筋胶原蛋白回收率58.56%,蛋白质含量48.4%。优化后的条件下提取的鹿筋胶原蛋白对MC3T3细胞具有显著的增殖作用,其增殖作用呈量效关系,当浓度为8 mg/mL时,增殖作用最为显著。因此,鹿筋胶原蛋白提取条件优化后,回收率增加;鹿筋胶原蛋白对体外培养的成骨细胞具有明显的增殖作用,为其产品的开发提供理论依据。

响应面法优化鹿筋蛋白提取工艺及体外抗类风湿性关节炎活性

目的:优化鹿筋蛋白提取工艺,探究其对类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞(MH7A)增殖及炎症因子分泌的影响。方法:以料液比、提取温度、提取时间为自变量,鹿筋蛋白含量为因变量,进行单因素实验,结合Box-Behnken试验设计,获得鹿筋蛋白最佳提取工艺。采用60 ng/mL肿瘤坏死因子-α(TNF-α)体外诱导MH7A细胞,MTT法测定不同浓度的(25、50、100、200μg/mL)鹿筋蛋白对MH7A细胞增殖抑制活性的影响;酶联免疫法测定细胞上清液中NO(一氧化氮)、白细胞介素-6(IL-6)、TNF-α含量。结果:鹿筋蛋白最佳提取条件为料液比1∶21 g/mL、提取温度88℃、提取时间8.6 h,此条件下测得鹿筋蛋白含量为12.53%。体外活性实验结果表明,与模型组比较,不同浓度(25、50、100、200μg/mL)的鹿筋蛋白均可显著(P<0.05)抑制MH7A细胞的增殖和NO、IL-6、TNF-α的释放(P<0.05),模型组的NO、IL-6、TNF-α释放量分别为:4.07、21.95、16.31 pg/mL,在100μg/mL质量浓度下,鹿筋蛋白对上述三种炎症因子释放的抑制作用最显著(P<0.05),其释放量分别为:1.60、13.60、7.29 pg/mL。结论:鹿筋蛋白通过抑制TNF-α诱导的MH7A细胞增殖,同时减少炎症因子NO、IL-6、TNF-α的释放,发挥其抗类风湿性关节炎的作用。本研究为研究鹿筋蛋白的制备工艺提供参考,并证明鹿筋蛋白具有较好的体外抗类风湿性关节炎活性。

酶解前后鹿筋体外抗炎活性与其氨基酸组成的相关性

目的:分析酶解前后鹿筋对TNF-α诱导的MH7A细胞抗炎作用的影响。方法:采用MTT法检测鹿筋天然蛋白(DSNP)和鹿筋酶解蛋白(DSEP)不同分子量的超滤组分的增殖抑制活性,筛选增殖抑制活性最佳的组分,测定活性组分对MH7A细胞分泌炎症因子(NO、IL-6)的影响,分析鹿筋酶解前后活性组分中氨基酸组成及含量。采用多元统计分析找出酶解前后鹿筋的差异性氨基酸与抑制MH7A细胞分泌炎症因子之间的关系。结果:酶解前后鹿筋不同的超滤组分中,DSNP-5、DSEP-5对MH7A细胞增殖抑制的作用最强(P<0.05),且能够抑制细胞炎症因子NO、IL-6的分泌。质量浓度为25~200μg/mL时,DSNP-5给药组炎症因子(NO、IL-6)的释放量均低于DSEP-5给药组,具有显著差异(P<0.05),说明DSNP-5抑制能力更强。酶解前后鹿筋的氨基酸组成基本一致,但含量存在明显差异,其中甘氨酸既是特征性差异成分,又与抑制MH7A细胞分泌炎症因子NO、IL-6密切相关,且DSNP-5的甘氨酸含量(31.01%)高于DSEP-5的甘氨酸含量(28.91%)。结论:甘氨酸为鹿筋酶解前后与抗炎活性相关的差异氨基酸,初步探究酶解对鹿筋抗炎活性的影响,为鹿筋的开发应用提供可靠依据。

鹿筋胶原蛋白多肽透皮吸收试验研究

研究2种酶解法制备得到的鹿筋胶原蛋白多肽对体外皮肤吸收的影响。采用单酶法和双酶法制备得到2种鹿筋胶原蛋白多肽DSCP-1和DSCP-2,以离体小鼠的皮肤为透皮屏障,应用透皮吸收仪,分别于不同时间取样,测定透皮液中蛋白质的透皮率和分子量分布。结果表明,鹿筋胶原蛋白多肽经透皮试验后,透皮液中分子质量主要分布在5~26 k Da之间,约占80%以上;DSCP-1的透皮率为3.83%,DSCP-2的透皮率为6.15%。2种酶解方法制备得到的胶原蛋白多肽均可透过皮肤,双酶法制备得到的鹿筋胶原蛋白多肽更易于透过皮肤。

鹿筋胶原蛋白多肽对骨细胞的作用

目的研究鹿筋胶原蛋白中氨基酸组成及其对骨细胞的作用。方法以双酶法制备的鹿筋胶原蛋白多肽为研究对象,利用柱前衍生化的方法测定其氨基酸的相对含量;采用MTT法检测其对C518软骨细胞和MC3T3-E1成骨细胞的增殖作用。结果在鹿筋胶原蛋白中,甘氨酸相对含量最高,为31.81%,羟脯氨酸的相对含量为6.99%,符合胶原蛋白组成的特点。与对照组比较,鹿筋胶原蛋白多肽对C518细胞、MC3T3-E1细胞均具有显著的增殖作用,其增殖作用呈量效关系,当浓度为200μg/m L时,增殖作用最为显著。结论鹿筋胶原蛋白多肽对骨细胞具有明显的增殖作用,为其产品的开发提供理论依据。

响应面法优化鹿筋胶原蛋白酶解工艺及其氨基酸含量

对鹿筋进行深入加工、开发、利用,采用响应面法优化鹿筋胶原蛋白酶解工艺。以酶解温度、酶解时间、pH为自变量,鹿筋胶原蛋白水解度为因变量,进行单因素试验,采用Box-Behnken法进行响应面试验设计,确定鹿筋胶原蛋白的最佳酶解工艺。通过氨基酸分析,初步研究鹿筋胶原蛋白的特征性质。结果表明,最佳酶解工艺为pH 9.4,酶解时间5 h,酶解温度53℃(初始底物浓度3%、酶底比1%)。在此条件下,水解度为31.07%。氨基酸分析结果表明,鹿筋胶原蛋白的氨基酸组成中,甘氨酸含量最高,约占氨基酸总含量的30.25%,同时脯氨酸和羟脯氨酸含量也较高,分别占氨基酸总含量的8.24%和6.05%,符合胶原蛋白特征性质。