玉米ZmDHN15基因在烟草中的遗传转化及抗冷性分析

玉米起源于亚热带,是喜温作物,易受低温胁迫的影响,脱水素(dehydrin,DHN)作为胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein,LEA)Ⅱ家族成员,是一类在植物非生物胁迫中发挥重要功能的蛋白。本研究克隆获得ZmDHN15基因,使用生物信息学手段,实时荧光定量PCR等技术对该基因的基本特性、组织表达特性进行分析,并进行植物过表达载体的构建及烟草的遗传转化,对T2代阳性植株进行抗冷性功能验证。结果表明,ZmDHN15基因全长1442 bp,共编码290个氨基酸,分子量为31.44 kD,理论等电点为6.05,是亲水性非跨膜蛋白,具有脱水素家族特有保守结构域。RT-qPCR分析表明ZmDHN15基因的在玉米叶片中表达量较高且在冷胁迫条件下表达量增加;获得T2代转基因烟草植株9株;在冷胁迫下转基因烟草与野生型相比,萌发率提高1.40倍,根长提高1.58倍,其叶片萎蔫程度更低,脯氨酸含量、丙二醛含量和过氧化物酶活性分别降低41.17%、28.47%和23.33%,可溶性糖含量、氧化物酶活性和超氧化物歧化酶活性分别升高58.97%、47.85%和47.53%,H_(2)O_(2)和O_(2)^(-)积累量分别减少34.78%和47.00%。综上所述,过表达ZmDHN15基因可以有效提高烟草植株对冷胁迫的耐受性,为进一步研究ZmDHN15基因在玉米中的功能奠定基础。

鸭梨DHN3基因鉴定及在果心褐变中的表达分析

为探究脱水素(dehydrin,DHN)蛋白与晚采鸭梨(Pyrus bretschneideri Rehd.)果心褐变之间的关系,基于生物信息学方法对鸭梨PbDHN3基因进行鉴定和特性分析,并分析急速降温和缓慢降温条件下晚采鸭梨果心褐变发生过程中PbDHN3基因的表达模式。结果表明,PbDHN3开放阅读框564 bp,编码187个氨基酸,且具有DHN的Dehydrin superfamily保守结构域,含有2个Y片段、1个S片段、3个K片段,属于Y_(2)SK_(3)型DHN。生物信息学分析表明Pb DHN3分子质量19.77 kDa,等电点7.98,为亲水性稳定蛋白;二级结构包含α-螺旋、无规卷曲、延伸链和β-转角,且定位于细胞核,不含信号肽与跨膜结构,为非分泌蛋白。同源性分析结果表明Pb DHN3与苹果等5种植物的DHN相似性达到89.74%以上,系统发育分析显示Pb DHN3和P. ussuriensis×P. communis的DHN亲缘关系最近。启动子分析结果表明PbDHN3含有基本启动子元件和其他顺式作用元件,与陆地棉GhDHN1及小麦TaDHN2启动子区预测结果一致,都包含激素响应元件、光响应元件等。实时聚合酶链式反应分析结果表明,急速降温条件下鸭梨果心部位DHN3基因在褐变过程中呈显著上调表达,与果心褐变紧密相关,为进一步探究该基因的功能,明确鸭梨果心褐变发生机制提供理论依据。

参与ABA调控小麦种子胚休眠的dehydrin基因的分离与表达分析

dehydrin蛋白是一个通过双向电泳分离出的参与ABA调控种子休眠过程的ABA反应蛋白。本研究利用二级质谱技术(Q-TOF2)获得了dehydrin蛋白的部分肽段序列,以此设计特异引物在万县白麦子中分离了其全长cDNA序列。与来自于durum小麦中的同源蛋白在DNA水平以及氨基酸水平进行序列比对,发现在3'与5'端以及编码区域都存在碱基变异。进一步从mRNA水平分析了dehydrin基因的表达变化与种子休眠性状的表达之间的关系,结果表明,该基因在转录水平上的表达特性与翻译水平一致,说明该基因早在转录水平就受ABA调控从而参与休眠性状的表达。

小麦脱水素基因TaDHN-1的特征及其对非生物胁迫响应

【目的】分析小麦脱水素基因特征及其在干旱、高盐、低温和高温胁迫过程中的表达模式,探讨脱水素在小麦抗逆过程中的功能,为脱水素基因在小麦抗逆分子育种中的应用提供理论依据。【方法】利用RT-PCR克隆小麦脱水素基因,通过生物信息学分析研究其编码蛋白特征;采用qRT-PCR分析该基因表达特性模式。【结果】克隆了包含完整编码区的小麦脱水素基因TaDHN-1,序列分析显示该基因cDNA长487 bp,编码112个氨基酸,推测编码蛋白分子量约为11.5 kD,等电点为6.6。氨基酸序列分析表明,TaDHN-1在C端具有保守的K片段,属于Kn类脱水素;二级结构预测显示,该脱水素无规则卷曲占整个蛋白的82.1%,具有很高的亲水性;PredictProtein预测显示,该脱水素无跨膜区域,亚细胞定位于细胞质中。表达特性分析表明,TaDHN-1受植物激素ABA的诱导;在干旱、高盐和低温胁迫条件下,该基因均受胁迫的诱导而表达上调,但对42℃高温胁迫不敏感;在种子发育过程中,TaDHN-1的表达呈下调趋势,且在种子发育后期的表达量极低,推测TaDHN-1不参与小麦种子成熟后期的脱水保护过程。【结论】小麦脱水素基因TaDHN-1属于脱水素基因家族的Kn亚类。该基因通过依赖ABA的非生物胁迫响应路径发挥功能,可能参与了小麦对干旱、高盐和低温胁迫的耐受调节过程,但对高温胁迫不敏感,也未参与种子发育后期的脱水保护过程。

大麦Dhn6基因的克隆、蛋白质结构预测与干旱胁迫表达模式

脱水素（Dehydrins,DHNs）是高等植物胚胎发育晚期产生的一类特异多肽,其表达累积程度与植物的发育阶段、低温、ABA和脱水信号调节等因素密切相关。为了解脱水素的结构与干旱胁迫表达累积反应,文章从六棱大麦分离到序列全长为1 767 bp的Dhn6基因,序列分析结果表明,该基因含一个92 bp内含子,90~1 759 bp为一个开放阅读框,与裸大麦Dhn6基因（GenBank登录号：AF043091）的同源性最高,达93.18%,编码523个氨基酸残基的多肽,预测蛋白质的分子量为49.68 kDa,理论等电点为8.04。结构分析发现,蛋白质具有3个螺旋区,无规则卷曲构成二级结构的主要组分,亲水氨基酸比例超过83%;三维结构预测发现,多肽链自身反向平行排列成松散的亲水索链,K-片段参与兼性？-螺旋结构域的形成,意味着该脱水素具有束缚自由水、稳定细胞膜相结构的功能。实时定量RT-PCR检测结果表明,Dhn6基因的相对表达水平在干旱处理8 h快速累积,推测DHN6在大麦对干旱胁迫的早期响应中发挥重要功能。

花生中胁迫相关基因AhDHN1的克隆及非生物胁迫下表达分析

低温、高盐和干旱胁迫严重影响作物的生长和产量。为了挖掘花生逆境胁迫相关功能基因,本研究以花生品种花育33号为试验材料,根据c DNA文库中已知的脱水素(dehydrin,Dhn)基因全长序列设计引物,通过RT-PCR克隆到该基因,并命名为AhDHN1。该基因编码框为384bp,编码128个氨基酸。序列分析表明该氨基酸序列含有两个保守的富含赖氨酸片段和一个保守的富含丝氨酸片段,表明该蛋白为K2S型脱水素。荧光定量PCR结果显示,AhDHN1基因在花生的叶片和根中对低温没有明显响应,对高盐和干旱胁迫则有明显响应,说明该基因可能参与了花生对高盐和干旱胁迫的适应性调控。本研究为阐明花生抗逆分子机理提供了理论基础,为花生抗逆分子育种提供了新的基因资源。

3种棱型大麦中脱水素6(DHN6)的性质、突变位点与蛋白质进化分析

脱水素(dehydrins,DHNs)是高等植物胚胎发育晚期产生的一类特异多肽,能够逆转细胞脱水所造成的伤害。为明确脱水素性质与功能的关系,本研究从3种棱型大麦分离到Dhn6基因,生物信息学分析其编码的蛋白质序列长度分别为523个(六棱)、502个(四棱)和486个(二棱)氨基酸残基;氨基酸突变位点分析发现该基因具有整体保守性和突变位点偏倚性。蛋白质性质与二级结构分析表明,DHN6是高度亲水的碱性蛋白质,线性结构和自由卷曲为二级结构的主要组分,K-片段参与α-螺旋结构的形成,由此推测DHN6的兼性α-螺旋结构域在稳定膜结构的水合保护体系过程中发挥着重要的生理功能。构建的21个物种DHN6蛋白质系统发生树,发现禾本科植物遗传距离较近,结合核苷酸序列的物种特异性,本研究认为Dhn6基因可作为物种鉴定依据。

扁蓿豆SK2型脱水素基因MrDHN3的异源表达提高大肠杆菌对盐和高温胁迫的抗性

扁蓿豆为高原高寒地区优质豆科牧草,具有极强的抗旱、耐寒、抗盐碱的能力。脱水素(DHNs)是参与植物逆境应答的一类蛋白。根据前期RNA-seq的结果,从扁蓿豆幼苗中克隆到一个编码脱水素的基因MrDHN3。序列分析显示该基因含666bp的开放阅读框,编码221个氨基酸,为一个SK2型酸性脱水蛋白。氨基酸序列比对结果表明,MrDHN3与豆科植物白三叶和蒺藜苜蓿相似性最高,达83%。实时荧光定量PCR结果显示,MrDHN3基因受脱水、低温、高盐和脱落酸处理诱导表达,表明MrDHN3参与了扁蓿豆的非生物胁迫响应。通过构建原核表达载体,在大肠杆菌中过表达MrDHN3蛋白,检测重组菌在盐和高温胁迫处理下的生长存活情况。结果发现,在0.5mol/L NaCl和0.5mol/L KCl高盐胁迫条件下,重组大肠杆菌的存活率明显高于对照菌株;在55℃高温胁迫条件下,转化大肠杆菌的生长状态明显优于对照。表明MrDHN3对盐和高温引起的细胞损伤具有保护作用。为今后作物抗逆性遗传改良的研究提供了有用信息。

植物脱水素响应逆境胁迫调控机制研究进展

脱水素(dehydrin,简称DHN)是一类广泛存在于植物体内响应逆境胁迫的亲水性蛋白,对逆境中农作物健康生长和果实积累至关重要。内蒙古地区瘠薄土壤中营养相对匮乏,盐碱化较为严重,植物经长期自然进化获得了分泌脱水素的功能,能够通过调控体内水分的蒸腾流失来稳定细胞质膜的结构,进而适应土壤干旱、高盐、高温等胁迫环境。因此,提高脱水素分泌量农作物品种的选育是实现可持续农业的重要途径。综述了脱水素蛋白的分子结构及其在不同逆境中的调控机制,以期为后续高产抗逆新品种农作物培育研究提供借鉴。

甜樱桃砧木PcDHN1的克隆及其对非生物胁迫的响应

为明确甜樱桃砧木脱水素基因特征及其在干旱、高盐和低温胁迫过程中的表达模式,以甜樱桃砧木Y1为材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆了甜樱桃砧木脱水素基因Pc DHN1,利用生物信息学分析其编码蛋白特征,并采用qRT-PCR分析该基因的表达模式。序列分析显示,甜樱桃砧木脱水素基因Pc DHN1的c DNA全长893 bp,编码225个氨基酸,推测编码蛋白分子量约为23.98 k D,理论等电点为8.65。氨基酸序列分析显示,Pc DHN1含有2个Y-片段、1个S-片段和2个K-片段,具有植物脱水素蛋白的特征性结构,属于YnSK2型脱水素。表达特性分析显示,Pc DHN1在干旱、高盐和低温胁迫条件下受胁迫诱导而上调表达,但对低温胁迫响应比较迟缓,说明该基因可能参与了甜樱桃砧木对干旱和高盐胁迫的耐受调节过程。本研究结果为甜樱桃砧木抗逆基因工程提供了一定的参考。

蒙古冰草脱水素基因生物信息学识别及表达分析

为挖掘蒙古冰草(Agropyron mongolicum Keng)干旱胁迫响应的脱水素基因,本研究在转录组测序数据的基础上,利用生物信息学方法对蒙古冰草脱水素基因进行理化性质、亚细胞定位、保守基序、系统发育进化分析,对不同干旱处理的脱水素基因进行差异表达分析。结果表明:共筛选到6个具有脱水素蛋白保守结构域的蒙古冰草脱水素基因,蛋白大小在81~275个氨基酸残基之间;分子量在0.83~2.75 kD之间;理论等电点在5.14~10.00之间;6个脱水素基因预测均位于细胞核;AmDHNs基因编码的蛋白均包括motif1和motif2;系统进化树发现DN14936_c0_g6,DN18948_c1_g4与已知具有抗旱功能的基因具有较高同源性。qRT-PCR分析与对照(CK)相比5个基因在干旱处理下显著差异表达,1个基因的表达量差异不显著,综合转录组测序数据和qRT-PCR分析表明6个基因的表达量随干旱处理时间延长总体呈上升趋势。本研究可为蒙古冰草抗旱相关脱水素基因的生物学功能验证提供理论基础。

棉花脱水素GhDHN1的克隆及其表达

【目的】通过对棉花脱水素基因结构特征及其在低温胁迫下表达模式进行分析,探讨脱水素在棉花响应低温过程中的功能,为棉花抗冷育种提供理论基础。【方法】以棉花抗冷品种豫2067为试验材料,根据棉花陆地棉基因组序列查找已知脱水素(dehydrin,Dhn)基因的CDS序列,利用Primer5软件设计引物,克隆该基因,并命名为GhDHN1;采用生物信息学方法分析其蛋白质性质、氨基酸含量特征、功能结构域、系统进化树;选择XbaⅠ和SmaⅠ酶切位点对植物表达载体p BI121::GFP进行双酶切,采用In-Fusion连接技术构建融合蛋白瞬时表达载体p BI121-GhDHN1::GFP;分析其在洋葱表皮细胞中的瞬时表达,进行亚细胞定位;利用抗冷材料豫2067在三叶期对低温处理(4℃,24 h)前后的叶片和根系进行转录组测序,筛选差异表达基因;在三叶期时分别对豫2067(抗冷品种)和衡棉3号(冷敏感品种)进行低温(4℃,24 h)处理,利用实时荧光定量方法分别比较根、茎、叶中GhDHN1表达量,对该基因在2个抗冷差异材料叶中的表达量进行比较;对豫2067进行不同时间低温(4℃)处理,分析GhDHN1在叶片和根中的动态表达模式。【结果】该基因全长为726 bp,开放阅读编码框为636 bp,编码211个氨基酸,预测分子量为23.79 k D,等电点为5.04,富含谷氨酸(26.10%)和赖氨酸(19.40%),不含色氨酸,半衰期为30 h,蛋白呈酸性,带负带荷,带负电荷的残基总数为60%;GhDHN1的二级结构α螺旋(Alpha helix)包含116个氨基酸残基,占54.98%,组成该蛋白的主体结构,无规则卷曲(Random coil)的氨基酸残基有87个;GhDHN1位于陆地棉D亚组第9染色体(Dt_chr9)上,在cDNA的259—348位置上含有一个长度为90 bp的内含子,2个外显子长度分别为258和378 bp;SMART和CDD分析表明该氨基酸序列含有2个保守的富含赖氨酸的K片段和1个保守的富含丝氨酸S片段,具有亲水素蛋白结构域pfam00257,表明该蛋白为K_2S型脱水素;系统进化树分析表明,陆地棉亲水素GhDHN1与可可亲缘关系最近;洋葱表皮细胞中瞬时表达分析表明,GhDHN1蛋白主要定位在细胞膜附近。转录组分析表明,该基因在棉花三叶期叶片和根中,受低温处理后上调表达;荧光定量PCR分析表明,GhDHN1在4℃低温胁迫24 h后,在叶片、茎、根中均上调表达,在叶中上调表达倍数最大,在低温处理4 h和24 h时叶片中有2个表达高峰,在低温处理6 h和12 h时在根中有2个表达高峰,在抗冷材料叶片中的表达是冷敏感材料的2.47倍,说明该基因可能参与了棉花对低温的适应性调控。【结论】陆地棉GhDHN1属于典型的K2S型脱水素,与可可亲缘关系最近。该基因响应低温胁迫,在抗冷材料和冷敏感材料中表达差异显著,其表达量与棉花的抗冷性呈正相关,可以作为筛选不同抗冷材料的标记,同时可以作为重要的候选基因来培育棉花抗冷新材料。

丹参DHN2基因的克隆与序列分析

本文以组织培养2～13周的丹参幼苗为材料,构建丹参cDNA文库并进行大规模EST序列分析,所得序列经NCBI的BLAST工具分析,克隆号为rsmsxl_014903.yl.scf序列与晚期胚胎丰富(late embryo-genesis abundant)基因家族Ⅱ中的成员有较高的同源性.该序列全长864bp,包含1个长726bp开放阅读框(ORF),编码241个氨基酸,并含有ⅡLEA蛋白的特征序列,与NCBI注册的脱水素家族基因具有较高的同源性,表明本基因可能是一种新的脱水素基因,命名为DHN2,并在GenBank上进行了注册,序列号为:AY737725.

橡胶树HbDHN1基因克隆及表达分析

采用Macroarray印迹杂交技术从本实验室构建的橡胶树机械伤害诱导的树皮抑制性差减杂交(SSH)cDNA文库中检测到1个差异表达EST。采用RT-PCR和RACE技术获得了该基因全长cDNA序列,包括124bp的5'端非编码区,337bp的3'端非编码区和1个编码224个氨基酸的开放阅读框。该cDNA编码的蛋白具有植物脱水素蛋白的特征性结构,属于SKn类脱水素蛋白,命名为HbDHN1,与其它植物的SKn类脱水素蛋白具有49.0%～68.2%的氨基酸序列同源性。RT-PCR分析表明,机械伤害对HbDHN1基因的表达没有明显影响,受伤组织的脱水显著上调该基因的表达。

巴西橡胶树脱水素基因HbDHN2的克隆及其氨基酸序列分析

脱水素(dehydrin,DHN)是存在于植物体内高度亲水的一类蛋白质,在植物响应和适应干旱、低温和盐渍等非生物胁迫过程中发挥重要作用。本研究在橡胶树已有转录组测序组装序列(TSA)数据的基础上,通过RT-PCR方法克隆了一个新巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)脱水素基因HbDHN2,并分析其氨基酸序列。结果表明,HbDHN2含210个氨基酸残基,与HbDHN1同为SK2型酸性脱水素,属于优先响应低温胁迫的脱水素类型(SKn)。

Pedhn基因的克隆及表达分析

为深入研究胡杨的抗盐分子机制,并获得与之相关的抗逆基因,采用SMART技术构建了胡杨盐胁迫处理cDNA文库。经随机测序,得到一个编号为SSL061的EST序列,与欧美杨的脱水素基因有较高相似性,通过PCR快速扩增文库的方法获得了胡杨脱水素基因(Pedhn)。分析表明,该cDNA的长度为813 bp,拥有681 bp的开放读码框,共编码227个氨基酸。该序列包括两个重复的富含赖氨酸的K片段和由7个连续的丝氨酸残基组成的S片段,但是缺乏Y片段。RT-PCR结果表明,胡杨在未受胁迫的情况下脱水素基因的转录水平较低,而随着盐胁迫浓度的升高,脱水素基因的转录水平总体呈上升趋势。

中华补血草和中亚滨藜叶片中盐激蛋白和dehydrin的研究

应用二相电泳方法,分析中华补血草Limonium sinensis(Girard.) O.Kuthze.和中亚滨藜AtriplexcentralasiaticaIljin 这二种典型泌盐植物叶片中的蛋白组成变化,发现盐胁迫时,二种植物叶片中均有少量的盐激蛋白出现,其中中亚滨藜叶片中的蛋白质组成变化大一些.运用Western- blot 方法对这二种盐生植物叶片中的dehydrin蛋白进行检测,结果发现,无论是在正常环境下,还是高浓度盐渍环境下。

羊草DHN3基因的克隆及其逆境响应的表达分析

该研究从羊草(Leymus chinensis)中克隆得到1个脱水素(Dehydrin,DHN)编码基因LcDHN3。通过序列分析表明,LcDHN3开放阅读框为501bp,编码167个氨基酸,分子量为17.01kD,理论等电点为8.05,为亲水性蛋白。LcDHN3蛋白具有脱水素的保守结构域,含有1个Y-片段、1个S-片段和2个K-片段,属于YSK2型脱水素。亚细胞定位预测LcDHN3蛋白定位在细胞质和细胞核。同源比对分析显示,LcDHN3与大麦(Hordeum vulgare)等6种植物的DHNs整体相似性为84.27%。进化分析显示,LcDHN3和大麦的DHN亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,LcDHN3基因的表达受干旱、冷、热、NaCl、高pH和机械损伤胁迫诱导,同时受植物激素ABA和JA的诱导。研究表明,LcDHN3参与了羊草响应逆境胁迫的信号途径。

牡丹类psDHN-YSK_2基因全长cDNA的克隆与表达分析

为了获得牡丹类脱水素基因的全长cDNA序列,推测其在休眠解除进程中的生物学功能,以不同低温处理时间的牡丹花芽为供试材料,末端快速扩增方法克隆全长cDNA序列,实时定量PCR分析其表达模式。结果表明,牡丹类脱水素基因全长cDNA序列为1187bp,包括831bp的开放阅读框,114bp的5’非编码区和242bp的3’非编码区。其编码的蛋白具有2个植物脱水素蛋白特征性K片段,根据Close的分类方法,属于YSK2类脱水素蛋白。系统发生分析表明,psDHN-YSK2基因与葡萄亲缘关系最近。在花芽内休眠解除前期随着低温处理时间的延长,psDHN-YSK2表达呈上调趋势。本研究克隆了牡丹psDHN-YSK2的全长cDNA序列,分析了其在花芽内休眠解除过程的表达趋势,暗示了其参与了牡丹花芽的内休眠过程。

红海榄脱水素基因(RsDHN1)的克隆及表达分析

采用RT-PCR和RACE技术对已获得的红海榄根部其中一个差异表达基因进行克隆,通过Blast分析和序列比对可知,该基因全长cDNA序列包括146bp的5'端非编码区,43bp的3'端非编码区和一个编码241个氨基酸的开放阅读框,命名为RsDHN1基因。该cDNA编码的蛋白具有植物脱水素蛋白的特征性结构,属于SKn类脱水素蛋白,与其它植物的SKn类脱水素蛋白具有43%～55%的氨基酸序列同源性。半定量RT-PCR分析表明,盐胁迫对RsDHN1基因的表达有明显上调作用。