豚鼠耳蜗单离Deiters细胞分离方法及活性判定标准

目的 探讨分离单离Deiters细胞的方法及活性判定标准。方法 分别用胶原酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶消化基底膜后结合机械吹打分离出Deiters细胞 ,观察并计数。结果 单离的Deiters细胞呈豆点状 ,分胞体、柄、指突三部分 ,平均每双侧耳可分离到 2 0～ 32个单离的Deiters细胞。活性标准 :细胞膜光滑 ,双折射现象存在 ,细胞核位置正常 ,指突完整 ,无呈布朗运动的颗粒。结论 三种常用的酶孵育后结合吹打法均可以分离出相当数量且具有活性保存较好的单离Deiters细胞 ;

豚鼠耳蜗单离外毛细胞和Deiters细胞的钾离子电流及其生理功能

目的 研究豚鼠耳蜗单离外毛细胞 (OHC)和Deiters细胞的钾离子电流及其特性 ,观察乙酰胆碱(ACh)和三磷酸腺苷 (ATP)对离子电流的影响。方法 运用全细胞膜片钳技术 ,分别记录单离OHC和Deiters细胞的离子电流。结果 OHC的长度不同 ,其钾离子电流表达具有差异性 ,短OHC具有较大外向电流和内向电流。ACh对短OHC钾离子电流的影响较大 ,其作用是使OHC超极化。ATP介导的OHC内向电流是非选择性的阳离子电流。ATP介导Deiters细胞出现内向离子电流。结论 K+ 电流在OHC的电谐振中非常重要。Deiters细胞能够通过减少K+ 外流、增加K+ 内流来缓冲周围环境中K+ 浓度的变化。

胞外钙对豚鼠耳蜗Deiters细胞钾电流的调制

为观察胞外钙对豚鼠耳蜗单个离体Deiters细胞钾电流的调控作用并探讨其机制,实验记录了:Deiters细胞在正常细胞外液和无钙外液中的全细胞钾电流(whole cell K+ currents,Ik),并分析了其电生理学特性的改变。结果观察到,Deiters 细胞与在正常细胞外液中相比,在祛除细胞外液中的Ca2+后,IK电流幅值明显增加,弦电导值亦明显增加,但其平衡电位未明显改变。在无钙外液中,Ik电流的反转电位向超极化方向明显移位,更接近于按照Nernst方程得出的K+理论平衡电位;而且其稳态激活曲线亦向超极化方向明显移位,但其激活趋势与正常相比无明显改变。此外,观察了Deiters细胞中钙抑制性钾电流的电流-电压关系和电导-电压关系,发现两者均呈“S”形,提示此钙抑制性钾电流可能存在2种不同的钾电导成分。由此,推测可能有两种机制参与胞外钙对Deiters细胞钾电流的调控:(1)Deiters细胞中的IK通道可能存在一个Ca2+敏感结构域,胞外Ca2+可能通过改变此结构域而对IK电流产生调制;(2)Deiters细胞中可能存在一种新型的双相门控性钾通道或钾通道耦联型受体或是一种新型的钾通道亚型,祛除胞外Ca2+可激活此新型钾电导而对IK电流产生调制。由此推测,在听觉形成过程中,胞外钙浓度下降可以对Deiters细胞的全细胞钾电流产生调制,从而更有利于Deiters细胞内K+外流,进而有效地缓冲外毛细胞周围的K+浓度;而且还可以使Deiters细胞产生更快的复极化并有利于维持其静息状态。

利诺吡啶对豚鼠耳蜗外毛细胞和Deiters细胞钾电流的抑制(英文)

为探讨KCNQ家族钾通道在耳蜗外毛细胞和Deiters细胞的功能性表达,我们观察并记录了 KCNQ家族钾通道阻滞剂利诺吡啶对豚鼠耳蜗单离外毛细胞(outer hair cells,OHCs)和Deiters细胞总钾电流的影响。采用酶孵育加机械分离法分离豚鼠耳蜗单个OHCs和Deiters细胞:运用膜片钳技术,在全细胞模式下记录正常细胞外液中8个外毛细胞和5个Deiters细胞的总钾电流,并观察100μmol/L和200μmol/L利诺吡啶对外毛细胞和Deiters细胞总钾电流的影响。结果观察到,在正常细胞外液中的单离外毛细胞,可记录到四乙基二乙胺敏感的外向性钾电流和静息膜电位附近激活的内向性钾电流(the K+ current activated at negativepotential,IKn)两种钾电流,而在单离Deiters细胞中只记录到外向整流性钾电流。在细胞外液中,加入100μmol/L利诺吡啶后,OHCs中的四乙基二乙胺敏感的钾电流峰电流成分被抑制,稳态电流幅值减小,且电流的失活时间常数明显延长;在细胞外液中加入100μmol/L和200μmol/L利诺吡啶后,OHCs的内向性钾电流IKn被完全抑制;而细胞外液中利诺吡啶终浓度为200μmol/L时,Deiters细胞的外向整流性钾电流幅值无明显变化。由此我们推测,KCNQ家族钾通道存在于豚鼠耳蜗外毛细胞,其介导的钾电流是四乙基二乙胺敏感的钾电流的组成部分。

二甲双胍通过NLRP3炎症小体通路对皮肤角质形成细胞增殖和凋亡的双向调节研究

背景扁平苔藓是一种皮肤-黏膜慢性炎症性疾病。因其病因不明,许多患者治疗效果欠佳,严重影响生活质量,有必要深入研究扁平苔藓的发病机制,为其药物筛选提供新靶点。目的探讨二甲双胍通过NLRP3炎症小体通路对皮肤角质形成细胞增殖和凋亡的调控作用。方法实验时间为2020—2023年。体外实验以人永生化角质形成细胞株HaCaT为研究对象,分为4组:对照组、脂多糖(LPS)组(5μg/mL)、二甲双胍组(Met组:10 mmol/L)、LPS与二甲双胍联合组(LPS+Met组:LPS 5μg/mL刺激2 h后,再给予二甲双胍10 mmol/L处理)。体内实验以BALB/c小鼠为研究对象,利用咪喹莫特涂抹小鼠背部皮肤诱导了银屑病样皮炎模型,并制备了二甲双胍乳膏进行治疗,将小鼠随机分为3组:对照组、咪喹莫特组(IMQ组)、咪喹莫特与二甲双胍联合组(IMQ+Met组),每组10只;对照组小鼠于背部涂抹凡士林,IMQ组小鼠于背部涂抹咪喹莫特软膏,IMQ+Met组小鼠于背部涂抹IMQ软膏12 h后再涂抹二甲双胍乳膏;1次/d,连续7 d。采用细胞增殖试剂盒(CCK-8)和流式细胞术检测二甲双胍对HaCaT细胞增殖和凋亡的影响;采用Western Blotting、酶联免疫吸附实验(ELISA)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)活性实验检测二甲双胍处理HaCaT细胞后NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体通路的蛋白表达情况及活性水平;最后采用皮肤组织切片苏木素-伊红(HE)染色和免疫组化检测二甲双胍对咪喹莫特诱导银屑病小鼠皮炎的抗炎效果。结果CCK-8实验结果显示:LPS组、Met组、LPS+Met组HaCaT细胞48 h存活率均低于对照组,而LPS+Met组HaCaT细胞48 h存活率高于LPS组(P<0.05)。流式细胞术结果显示:LPS组、Met组HaCaT细胞48 h G2/M期细胞、细胞凋亡比例均高于对照组,而LPS+Met组HaCaT细胞48 h G2/M期细胞、细胞凋亡比例低于LPS组(P<0.05)。Western Blotting结果显示:LPS组、Met组HaCaT细胞NLRP3炎症小体通路Caspase-1 p40、Caspase-1 p20、白介素(IL)-1β、IL-18蛋白表达均高于对照组,而LPS+Met组HaCaT细胞NLRP3炎症小体通路Caspase-1 p40、Caspase-1 p20、IL-1β、IL-18蛋白表达低于LPS组(P<0.05)。ELISA实验结果显示:LPS组、Met组HaCaT细胞NLRP3炎症小体通路IL-1β、IL-18水平、Caspase-1相对活性均高于对照组,而LPS+Met组HaCaT细胞NLRP3炎症小体通路IL-1β、IL-18水平、Caspase-1相对活性低于LPS组(P<0.05)。皮肤组织切片HE染色显示:IMQ+Met组小鼠二甲双胍涂抹明显改善了咪喹莫特对皮肤的损害。免疫组化结果显示:IMQ+Met组小鼠则显著降低了NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的表达。结论二甲双胍通过NLRP3炎症小体通路双向调节皮肤角质形成细胞的增殖和凋亡,并能够改善咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠的皮肤损害,有望为二甲双胍临床上用于治疗扁平苔藓提供理论依据。

单细胞转录组测序技术在骨质疏松症研究中的应用与进展

背景:骨质疏松导致的脆性骨折发病率逐年上升,亟需探索其病理生理、潜在生物标志物、治疗靶点及有效药物。骨微环境中存在多种细胞,对骨代谢的维持至关重要。近几年,单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术被开发用于表征单个细胞的转录组,并逐步应用到骨质疏松症防治的研究。目的:综述单细胞转录组测序技术在骨质疏松症研究中的应用与进展。方法:由第一作者使用计算机检索Web of Science,PubMed和中国知网数据库中2009-2023年出版的文献,英文检索词为:“single-cell RNA sequencing,bone marrow derived stromal cells,osteoblasts,osteocytes,osteoclasts,immune cells,Bone marrow vascular endothelial cells”;中文检索词为:“单细胞转录组测序,骨髓间充质干细胞,成骨细胞,骨细胞,破骨细胞,免疫细胞,骨髓血管内皮细胞”;通过阅读筛选相关文献,最终纳入89篇文献进行综述分析。结果与结论:①单细胞转录组测序技术能够深入了解细胞发育、增殖、分化的轨迹及其调控机制。②影响骨密度的候选基因主要富集在骨髓间充质干细胞亚群,其中Sox9是关键的转录因子。③成骨细胞不同亚群中差异表达Runx2控制骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化。④破骨细胞分化过程中RAB38与组蛋白修饰和转录调控动态变化有关。⑤单细胞层面研究证实,骨微环境中存在多种细胞间通讯,破骨细胞可能通过CD160-TNFRSF14配体-受体结合进行细胞间通讯;中性粒/单核细胞与成骨细胞间可能通过RESISTIN通路进行交互;浆样树突状细胞与成骨细胞系通过表皮生长因子通路进行交流;均可以为靶点预测和药物研发提供方向。⑥新的骨髓毛细血管内皮细胞亚群,称为S型内皮细胞,完全起源于骨骺次级骨化中心,甚至比H型血管更具有可塑性。⑦文章从细胞角度总结单细胞转录组测序技术在表征不同骨组织细胞的分化命运和分化轨迹、识别新的细胞亚群、鉴定细胞调控因子及明确细胞间通讯的研究进展,为探讨骨质疏松症的病理机制、筛选潜在诊断标志物、预测治疗靶点及探究药物作用机制提供细胞层面的信息。⑧未来单细胞测序技术将向单细胞多组学(基因组、蛋白组学及代谢组学)方向及结合其他诸如空间转录组技术为骨组织细胞变化提供更有价值的信息。

脱细胞软骨细胞外基质匀浆联合氧化苦参碱治疗大鼠骨关节炎

背景:脱细胞软骨细胞外基质治疗骨关节炎具有一定的效果,但其单独应用时的治疗效果有限。氧化苦参碱可缓解白细胞介素1β诱导的软骨细胞凋亡和细胞外基质降解。目的:观察不同剂量氧化苦参碱与脱细胞软骨细胞外基质联合膝关节腔注射对大鼠骨关节炎的治疗作用。方法:获取SD大鼠股骨软骨,采用物理、化学与酶相结合的方法制备脱细胞软骨细胞外基质。取50只SD大鼠,利用随机数字表法分为假手术组、骨关节炎组、单纯材料组、低剂量药物组、高剂量药物组,每组10只,后4组采用改良Hulth法建立大鼠骨关节炎模型。造模成功后,单纯材料组大鼠膝关节腔注射脱细胞软骨细胞外基质匀浆,低剂量药物组、高剂量药物组膝关节腔分别注射含50,100μg氧化苦参碱的脱细胞软骨细胞外基质匀浆。注射4周后取材进行相关检测。结果与结论:①与假手术组比较,骨关节炎组关节腔积液中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子ɑ、丙二醛水平升高(P<0.05),超氧化物歧化酶水平降低(P<0.05);与骨关节炎组比较,低剂量药物组、高剂量药物组关节腔积液中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子ɑ、丙二醛水平降低(P<0.05),超氧化物歧化酶水平升高(P<0.05),其中高剂量药物组变化更显著。②Tunel染色显示,与假手术组相比,骨关节炎组凋亡软骨细胞增多;与骨关节炎组相比,单纯材料组、低剂量药物组、高剂量药物组凋亡软骨细胞减少,其中高剂量药物组减少更显著。③苏木精-伊红与免疫组化染色显示,骨关节炎组大鼠膝关节软骨严重退变,软骨组织中Ⅱ型胶原表达降低(P<0.05)、基质金属蛋白酶9表达升高(P<0.05);与骨关节炎组相比,单纯材料组、低剂量药物组、高剂量药物组大鼠膝关节软骨退变明显改善,软骨组织中Ⅱ型胶原表达升高(P<0.05)、基质金属蛋白酶9表达降低(P<0.05),其中高剂量药物组改善最显著。④Western blot检测显示,与假手术组相比,骨关节炎组软骨组织中Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05),Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Bax蛋白表达升高(P<0.05);与骨关节炎组相比,低剂量药物组、高剂量药物组Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05),Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Bax蛋白表达降低(P<0.05),其中高剂量药物组改善更显著。⑤结果表明,膝关节腔内联合注射脱细胞软骨细胞外基质与氧化苦参碱可通过促进细胞外基质的合成、抑制炎症与氧化应激反应、抑制软骨细胞凋亡发挥骨关节炎治疗作用,该治疗作用可能与激活Nrf2/HO-1通路有关。

外源性碱性成纤维细胞生长因子促进大鼠创面愈合的机制

背景:深入揭示外源性碱性成纤维细胞生长因子促进创面愈合的分子机制。目的:探讨外源性碱性成纤维细胞生长因子对大鼠创面修复中巨噬细胞表型转换和肉芽再生的影响。方法:(1)体外细胞实验:分为正常对照组、低剂量碱性成纤维细胞生长因子组、高剂量碱性成纤维细胞生长因子组以及碱性成纤维细胞生长因子+丙戊酸组,其中低、高剂量碱性成纤维细胞生长因子组细胞培养基中分别添加100,200μg/L碱性成纤维细胞生长因子,碱性成纤维细胞生长因子+丙戊酸组细胞培养基中添加200μg/L碱性成纤维细胞生长因子和20 mmol/L Notch1/Jagged1激动剂丙戊酸。通过EdU实验、划痕实验、小管生成实验检测碱性成纤维细胞生长因子对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移和血管新生的影响。(2)体内动物实验:SD大鼠按照随机数字表法分为模型组、低剂量碱性成纤维细胞生长因子组、高剂量碱性成纤维细胞生长因子组以及碱性成纤维细胞生长因子+丙戊酸组,构建大鼠全层皮肤缺损开放性创面模型,其中低、高剂量碱性成纤维细胞生长因子组皮下注射100,200μg/L碱性成纤维细胞生长因子,碱性成纤维细胞生长因子+丙戊酸组大鼠皮下注射200μg/L碱性成纤维细胞生长因子的同时腹腔注射10 mg/kg丙戊酸。给药7,14 d检测大鼠创面的愈合率;TUNEL检测创面组织中的细胞凋亡情况;酶联免疫吸附实验检测大鼠血清中丙二醛、超氧化物歧化酶、肿瘤坏死因子α和白细胞介素10水平;免疫荧光检测创面组织中巨噬细胞的表型转换情况;免疫组化检测创面组织中增殖细胞核抗原、CD31和血管内皮生长因子的表达;Western blot法检测创面组织中Notch1、Jagged1的表达。结果与结论:(1)与正常对照组相比,碱性成纤维细胞生长因子能明显促进人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移和血管新生,并且具有剂量依赖性;(2)与模型组相比,碱性成纤维细胞生长因子能明显促进创面的愈合,下调创面组织中的细胞凋亡率;降低大鼠血清中丙二醛和肿瘤坏死因子α水平,升高超氧化物歧化酶和白细胞介素10水平;促使创面组织中巨噬细胞向M2型转换,上调创面组织中增殖细胞核抗原、CD31和血管内皮生长因子的表达;抑制创面组织中Notch1、Jagged1的表达,并且均具有剂量依赖性。丙戊酸可部分逆转碱性成纤维细胞生长因子对创面愈合的促进作用。结果表明,碱性成纤维细胞生长因子能明显促进创面愈合与肉芽再生以及诱导巨噬细胞向M2型转换,这可能与调控Notch1/Jagged1信号有关。

干细胞治疗肌萎缩侧索硬化症:细胞来源、数量、修饰手段及给药途径

背景:随着医疗技术的不断进步,干细胞疗法已经被用于包括肌萎缩侧索硬化症在内的多种疾病的治疗。目的:综述干细胞治疗肌萎缩侧索硬化症的研究进展,展望该领域的发展趋势。方法:以“肌萎缩侧索硬化症,间充质干细胞,神经干/祖细胞,多能诱导干细胞;amyotrophic lateral sclerosis,mesenchymal stem cells,neural stem/progenitor cells,pluripotent stem cells”为关键词,在PubMed、中国知网、万方数据库进行检索,检索时限为1995-2024年。共检索到1700余篇文献,最终纳入58篇文献用于综述。结果与结论:肌萎缩侧索硬化症是一种影响脑干和脊髓的下部运动神经元以及运动皮质的上部运动神经元的神经退行性疾病。干细胞治疗肌萎缩侧索硬化症的相关研究已成为一大研究热点。在这篇综述中,总结了不同种类干细胞在肌萎缩侧索硬化症研究领域中的应用情况,包括间充质干细胞、神经干祖细胞、多能诱导干细胞,评估了干细胞来源、细胞量、干细胞修饰手段及给药途径等临床前研究关键,为未来干细胞治疗的应用奠定了基础。

盐酸青藤碱抑制急性T淋巴细胞白血病CEM细胞株的作用及转录组学分析

背景:盐酸青藤碱有抗多种肿瘤的作用,但目前尚不清楚盐酸青藤碱对急性T淋巴细胞白血病的作用。目的:探讨盐酸青藤碱对急性T淋巴细胞白血病CEM细胞的抑制作用。方法:应用不同浓度(0.5,1,2,4 mmol/L)盐酸青藤碱处理CEM细胞,CCK-8检测细胞增殖抑制率并计算IC50;倒置显微镜和吉姆萨染色观察CEM细胞形态变化;利用RNA-Seq测序分析差异基因表达并进行生物信息学分析。结合转录组测序结果,流式细胞术检测不同浓度(1,2,4 mmol/L)盐酸青藤碱作用后CEM细胞凋亡率;Western blot检测不同浓度(1,2,4 mmol/L)盐酸青藤碱作用后CEM细胞中Bcl-2、Bax、Caspase-9蛋白的表达。结果与结论:①盐酸青藤碱呈剂量和时间依赖性地抑制CEM细胞生长;②盐酸青藤碱干预后CEM细胞数量下降,核固缩;③RNA-seq测序筛出53个异常表达基因,基因本体分析主要富集在细胞过程、细胞解剖实体与粘连关系等,信号通路分析与肿瘤相关的是细胞凋亡;④盐酸青藤碱呈剂量依赖性地促进CEM细胞凋亡;⑤盐酸青藤碱上调CEM细胞中Bax、Caspase-9蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达。由此可见,盐酸青藤碱可诱导CEM细胞凋亡从而抑制细胞增殖,可能与其上调Bax和Caspase-9蛋白表达,以及下调Bcl-2蛋白表达有关。

血管生成素样蛋白4通过调节成纤维细胞和内皮细胞功能影响糖尿病足进程

背景:研究表明,血管因素对糖尿病足的发生具有重要影响。目的:探讨血管生成素样蛋白4在糖尿病足形成中的重要作用。方法:①对糖尿病足患者的基因表达谱数据进行生物信息学分析,找到关键基因。收集糖尿病足患者以及无糖尿病健康人的皮肤标本进行苏木精-伊红染色、免疫组化染色以及qRT-PCR实验,检测血管生成素样蛋白4表达情况。②培养人永生化皮肤成纤维细胞系和原代人脐静脉内皮细胞,将2种细胞分别分为对照组和外源性补充血管生成素样蛋白4组,通过划痕实验以及CCK-8实验分别检测成纤维细胞的迁移能力和增殖能力,通过Ki67实验检测内皮细胞的增殖能力。结果与结论:①生信分析发现,血管生成素样蛋白4基因的下调可能是导致糖尿病足形成的关键基因。②苏木精-伊红染色结果显示,与正常皮肤相比,血管生成素样蛋白在糖尿病足皮肤内弱表达,且其mRNA水平相对表达量降低(P<0.01)。③划痕实验结果显示,与对照组相比,血管生成素样蛋白4组成纤维细胞迁移能力明显增强;CCK-8细胞增殖实验显示,血管生成素样蛋白4组成纤维细胞的吸光度值在24,48 h均高于对照组(P<0.01,P<0.001);提示血管生成素样蛋白4可增强高糖处理的成纤维细胞迁移及增殖能力。④Ki67实验结果显示,与对照组相比,血管生成素样蛋白4组内皮细胞Ki67阳性细胞数目明显多于对照组;CCK-8细胞增殖实验显示,血管生成素样蛋白4组内皮细胞的吸光度值在24,48 h均高于对照组(P<0.05,P<0.001)。(5)以上结果均提示血管生成素样蛋白4可增强高糖处理内皮细胞的增殖能力。

补骨脂素对环磷酰胺抑制小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的恢复作用

背景:补骨脂素具有很强的抗骨质疏松活性,可能对化疗导致的骨质疏松具有恢复作用。目的:探讨补骨脂素对环磷酰胺抑制小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的恢复作用及机制。方法:分离培养C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,以MTT法检测补骨脂素对骨髓间充质干细胞活力的影响,以成骨诱导结合碱性磷酸酶染色确定补骨脂素对环磷酰胺抑制骨髓间充质干细胞成骨分化恢复作用的最佳剂量。采用RT-qPCR法检测补骨脂素干预不同时间点成骨分化标志基因Runx2、ALP、Osteocalcin、骨保护素及Wnt/β-catenin信号通路相关基因Wnt1、Wnt4、Wnt10b、β-catenin、c-MYC的mRNA表达;采用Western blot法检测补骨脂素干预不同时间点成骨特异性转录因子Runx2及Wnt/β-catenin信号通路相关基因Activeβ-catenin、DKK1、c-MYC、Cyclin D1的蛋白表达。结果与结论:(1)不同浓度补骨脂素对骨髓间充质干细胞活力没有显著影响;200μmol/L补骨脂素干预后对环磷酰胺诱导骨髓间充质干细胞成骨分化抑制的恢复作用最佳;(2)补骨脂素可以逆转环磷酰胺条件培养基导致的骨髓间充质干细胞成骨标志基因Runx2、ALP、Osteocalcin、骨保护素mRNA表达和Runx2蛋白表达的降低;(3)补骨脂素可以逆转环磷酰胺条件培养基导致的骨髓间充质干细胞Wnt/β-catenin通路相关基因Wnt4、β-catenin、c-MYC mRNA表达和Activeβ-catenin、c-MYC、Cyclin D1蛋白表达的降低以及DKK1蛋白表达的升高;(4)结果表明,环磷酰胺能抑制小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化,补骨脂素对其具有恢复作用,且200μmol/L补骨脂素干预效果最佳,而这种保护作用可能与补骨脂素激活Wnt4/β-catenin信号通路有关。

8周运动预适应增强脂肪干细胞治疗心肌梗死大鼠的效果

背景:干细胞移植是心肌梗死的崭新疗法,然而梗死区域极其恶劣的微环境造成干细胞存活率低下并导致远期疗效甚微。运动预适应是一种通过运动诱导机体产生内源性保护效应的方式,可作为心脏康复预防与治疗的新策略。目的:评估运动预适应是否能够增强大鼠心肌梗死后脂肪干细胞移植的心脏保护效应,探讨血管生成在其中的作用机制。方法:6周龄雄性SD大鼠随机分为对照组、造模组、干细胞组以及干细胞运动组。利用冠状动脉闭塞术制作急性心肌梗死模型,对照组同期行假手术;干细胞运动组于造模前进行8周有氧运动,造模后30 min进行脂肪干细胞移植;干细胞组仅进行脂肪干细胞移植。干细胞移植后1 d和7 d,利用免疫印迹法测定心肌总Akt(t-Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、血管内皮生长因子(VEGF)、总内皮型一氧化氮合酶(t-eNOS)和磷酸化内皮型一氧化氮合酶(p-eNOS)蛋白表达量,计算p-Akt/t-Akt和p-eNOS/t-eNOS比值;4周后利用彩色多普勒超声诊断系统检测心脏结构与功能以及心肌血流量,TTC染色法检测心肌梗死面积,Masson染色法检测心肌间质胶原沉积,免疫荧光染色法测定心肌毛细血管密度,TUNEL染色法评估心肌细胞凋亡。结果与结论:(1)干细胞移植后4周:与对照组比较,造模组左心室缩短分数、左心室射血分数、心肌毛细血管密度和心肌血流量下降(P<0.05),心肌梗死面积、胶原容积分数和细胞凋亡增加(P<0.05);与造模组比较,干细胞组上述指标(除左心室缩短分数和左心室射血分数外)得到改善(P<0.05);与干细胞组比较,干细胞运动组以上各参数进一步改善(P<0.05)。(2)干细胞移植后1 d:与对照组比较,造模组t-Akt、p-Akt、VEGF、t-eNOS、p-eNOS蛋白表达量以及p-Akt/t-Akt、p-eNOS/t-eNOS比值均无显著性变化(P>0.05);与造模组比较,干细胞组上述指标均无显著性变化(P>0.05),干细胞运动组磷酸化p-Akt蛋白表达量以及p-Akt/t-Akt比值上调(P<0.05)。(3)干细胞移植后7 d:与对照组比较,造模组p-Akt、VEGF、p-eNOS蛋白表达量以及p-Akt/t-Akt、p-eNOS/t-eNOS比值下降(P<0.05);与造模组比较,干细胞组各参数均无显著性变化(P>0.05),干细胞运动组p-Akt、VEGF、p-eNOS蛋白表达量以及p-Akt/t-Akt、p-eNOS/t-eNOS比值升高(P<0.05)。结果表明:运动预适应可增强脂肪干细胞对心肌梗死大鼠心脏重塑的治疗效果,其机制与促进心肌血管生成并增加血流灌注有关。

高葡萄糖诱导的氧化应激和炎症反应介导髓核细胞的凋亡和细胞外基质代谢失衡

目的探讨高浓度葡萄糖处理对大鼠髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPC)凋亡和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)代谢的影响,并初步探讨可能的潜在机制。方法从雄性Wistar大鼠腰椎组织中分离NPC。将NPC分为6组:对照组,葡萄糖5、15、25 mmol/L组,葡萄糖+NAC组(25 mmol/L葡萄糖+3 mmol/L抗氧化剂NAC),葡萄糖+PDTC组(25 mmol/L葡萄糖+10μmol/L NF-κB通路抑制剂PDTC)。分别采用CCK-8、流式细胞术检测细胞活力和凋亡。采用荧光探针检测细胞内活性氧(reactive ox-ygen species,ROS)水平。酶联免疫吸附法用于检测IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。蛋白质印迹检测相关蛋白表达。结果与对照组比较,5 mmol/L葡萄糖组和15 mmol/L葡萄糖组的细胞活力和凋亡无明显变化,而25 mmol/L葡萄糖组细胞活力明显降低、细胞凋亡明显增加(P<0.05)。与25 mmol/L葡萄糖组比较,葡萄糖+NAC组和葡萄糖+PDTC组Bcl-2关联X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、基质金属蛋白酶MMP-3、MMP-9、MMP-13、金属蛋白酶AD-AMTS(A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs)-4和ADAMTS-5表达均明显降低,而Bcl-2蛋白、Ⅱ型胶原蛋白(collagenⅡ,COLⅡ)和聚集蛋白聚糖(aggrecan)表达均明显升高(P<0.05)。与25 mmol/L葡萄糖组比较,葡萄糖+NAC组和葡萄糖+PDTC组细胞内ROS水平和上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明显降低(P<0.05)。与25 mmol/L葡萄糖组比较,葡萄糖+NAC组和葡萄糖+PDTC组细胞p-P65/P65和p-IκBα/IκBα水平均明显降低(P<0.05)。结论高葡萄糖处理可通过诱导氧化应激和炎症反应促进NPC的凋亡和ECM降解,这一过程涉及其对ROS/NF-κB信号通路的激活。

乙酰胆碱和三磷酸腺苷介导的豚鼠外毛细胞和Deiters细胞的离子电流

目的 研究乙酰胆碱 (acetylcholine ,ACh)和三磷酸腺苷 (adenosinetriphosphate ,ATP)介导的豚鼠耳蜗单离外毛细胞 (outerhaircell,OHC)的离子电流。方法 应用全细胞膜片钳技术 ,记录不同的钳制电压对ACh和ATP介导的离子电流的影响以及不同浓度的ACh和ATP分别引致的离子电流。结果 10 0 μmol/LACh在钳制电压为 - 70mV时引出一个内向电流和一个外向电流 ,- 6 0mV以上只引出了外向电流 ,其反转电位为 (- 80± 5 6 1)mV(n =6 )。10 0 μmol/LATP在给予去极化钳制电压时 ,所引出的内向电流的幅度越来越小 ,在 (3 2± 0 2 3)mV(n =8)反转为外向电流。在单离的Deiters细胞上也记录出 10 0 μmol/LATP介导的离子电流。 结论 ACh介导的外向电流是一种钾离子电流 ,ATP介导的内向电流是非选择性的阳离子电流 。

豚鼠耳蜗单离Deiters细胞的钾电流

目的 研究豚鼠耳蜗单离Deiters细胞的钾电流及其特性。方法 运用膜片钳技术 ,在全细胞模式下记录正常细胞外液中钾电流 ,不同K+浓度的细胞外液对细胞反转电位和外向钾电流的影响 ,四氨基吡啶 (4 aminopyridine ,4 AP)和四乙基胺 (tetraethylammonium ,TEA)对钾电流成分的阻滞作用 ,探讨外向钾电流通道的激活和失活动力学。结果 单离Deiters细胞具有电压依赖的外向整流离子选择性通道 ;钾通道阻滞剂 4 AP和TEA可使峰电流和迟电流幅度下降 ,表明存在两种类型的钾通道 ,或者这种通道有两种不同的状态 ;通道的激活和失活符合Boltzmann方程。未记录到Deiters细胞的内向钙电流。

小肠黏膜下层脱细胞基质复合外泌体构建组织工程尿道

背景:小肠黏膜下层脱细胞基质已被临床与基础研究证实可用于尿道的修复重建,但其单独应用时存在宿主细胞生长缓慢、支架血管化不足而成活困难、重建尿道狭窄梗阻等问题,仅适用于较短的尿道狭窄。目的:探讨应用小肠黏膜下层脱细胞基质复合外泌体构建组织工程尿道的可行性。方法:从新西兰大白兔骨髓间充质干细胞中分离提取外泌体;制备猪小肠黏膜下层脱细胞基质,将外泌体负载于小肠黏膜下层脱细胞基质上。将小肠黏膜下层脱细胞基质-外泌体(PKH26染料标记)复合物与脐静脉内皮细胞共培养12 h,观察细胞摄取外泌体情况。选取生长状态良好的脐静脉内皮细胞,分3组培养:空白组常规培养,对照组加入小肠黏膜下层脱细胞基质,实验组加入小肠黏膜下层脱细胞基质-外泌体复合物,通过划痕实验、成管实验、血管生成因子分泌检测评估血管生成情况。取30只新西兰大白兔,建立长段(3 cm)尿道缺损模型,采用随机数字表法分3组干预(n=10):单独材料组植入小肠黏膜下层脱细胞基质,对照组植入小肠黏膜下层脱细胞基质-骨髓间充质干细胞复合物,实验组植入小肠黏膜下层脱细胞基质-外泌体复合物,植入后12周进行尿道造影、尿动力学检查及重建尿道切片病理观察。结果与结论:(1)荧光显微镜下可见小肠黏膜下层脱细胞基质中的外泌体可被脐静脉内皮细胞摄取。(2)与空白组、对照组相比,实验组材料可促进脐静脉内皮细胞的迁移、成血管能力以及成血管因子血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、白细胞介素8的分泌(P <0.05)。(3)尿道造影结果显示,单独材料组10只兔均出现尿道狭窄,对照组10只兔中2只出现尿道狭窄,实验组10只兔均未出现尿道狭窄。尿动力检查结果显示,单独材料组兔材料植入后12周的最大尿道压高于术前(P <0.05),对照组、实验组兔植入后12周的最大尿道压均低于空白组(P <0.05)。苏木精-伊红、Masson与免疫组化染色显示,单独材料组可见明显的再生上皮层、少量的皮下平滑肌与血管,以纤维组织增生为主,伴有明显炎性细胞浸润;对照组可见较完整的再生上皮与少量胶原,可见大量的皮下血管与平滑肌,伴有炎性细胞浸润;实验组可见完整的再生上皮层与大量的皮下血管、平滑肌,未见明显炎性细胞浸润,实验组AE1/AE3、ɑ-平滑肌肌动蛋白、CD31阳性表达均高于单独材料组、对照组(P <0.05)。(4)结果表明,小肠黏膜下层脱细胞基质-外泌体组织工程尿道可通过促进血管生成来修复尿道缺损。

法舒地尔缓解β-淀粉样蛋白1-42诱导的SH-SY5Y细胞凋亡

背景:法舒地尔对阿尔茨海默病小鼠脑内的线粒体动力学有调节作用,并且可以抑制神经炎症,但能否调节线粒体自噬和NLRP3炎症小体进而减轻β-淀粉样蛋白毒性尚不清楚。目的:探究法舒地尔对β-淀粉样蛋白1-42诱导的人源神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y凋亡和线粒体自噬以及NLRP3炎症小体的调节作用。方法:将SH-SY5Y细胞接种于孔板内,细胞贴壁后分3组干预:对照组不加入任何药物,模型组加入20μmol/L β-淀粉样蛋白1-42,法舒地尔组同时加入20μmol/L β-淀粉样蛋白1-42与15 mg/L法舒地尔,干预24 h后,采用MTT法检测细胞活性,TUNEL染色检测细胞凋亡,qRT-PCR和Western blot检测凋亡相关蛋白表达,免疫荧光染色和Western blot检测线粒体自噬相关蛋白表达,免疫荧光染色和Western blot检测NLRP3炎症小体相关蛋白表达。结果与结论:(1)与对照组比较,模型组细胞活性降低、凋亡率升高(P<0.05);与模型组比较,法舒地尔组细胞活性升高、凋亡率降低(P<0.05);(2)qRT-PCR和Western blot检测结果显示,与对照组比较,模型组细胞Bax mRNA与蛋白表达升高(P<0.05),Bcl-2 mRNA与蛋白表达降低(P<0.05);与模型组比较,法舒地尔组细胞Bax mRNA与蛋白表达降低(P<0.05),Bcl-2 mRNA与蛋白表达升高(P<0.05);(3)免疫荧光染色和Western blot检测结果显示,与对照组相比,模型组细胞PINK1、帕金森病蛋白和LC3蛋白表达降低(P<0.05),p62蛋白表达升高(P<0.05);与模型组相比,法舒地尔组细胞PINK1、帕金森病蛋白和LC3蛋白表达升高(P<0.05),p62蛋白表达降低(P<0.05);(4)免疫荧光染色和Western blot检测结果显示,与对照组相比,模型组细胞NLRP3、ASC、Caspase-1和白细胞介素1β蛋白表达升高(P<0.05);与模型组相比,法舒地尔组细胞NLRP3、ASC、Caspase-1和白细胞介素1β蛋白表达降低(P<0.05);(5)结果表明,法舒地尔可以减轻β-淀粉样蛋白1-42诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,其机制可能与激活线粒体自噬且抑制NLRP3炎症小体激活有关。

ASIP基因及其重组蛋白对山羊脂肪细胞脂肪沉积的效应

为探索ASIP基因对山羊脂肪沉积的效应,本研究采集波杂山羊(BZ)和酉州乌羊(YZ)组织,并使用体外培养的山羊前脂肪细胞,采用基因克隆、实时荧光定量(qRT-PCR)、油红O染色等方法,检测ASIP基因在山羊组织和体外培养分化脂肪细胞中的表达规律,以及脂质生成关键基因在山羊脂肪和肌肉组织中的表达情况,分析重组ASIP蛋白对山羊脂肪细胞分化过程中脂滴形成及脂质生成关键基因表达的影响。结果表明,ASIP基因在山羊体组织中广泛表达,在肾脏和白色脂肪中的表达量最高;ASIP基因在山羊脂肪细胞分化6 d时显著升高(P<0.05),8 d时达到最高值。PPARG、LEPTIN和ATRN基因在YZ肾脂中的表达量显著高于BZ(P<0.05);PPARG、FASN和ATRN基因在BZ骨骼肌中的表达量显著高于YZ(P<0.05),FABP4和SREBP1基因的表达在两品种羊之间无显著差异。重组ASIP蛋白处理诱导山羊脂肪细胞在8 d出现明显脂肪滴,显著提高了细胞内甘油三酯含量(TG)(P<0.05),并显著或极显著上调脂肪细胞中脂质合成关键基因(PPARG、LEPTIN、FASN、FABP4、SREBP1和ATRN)的表达量。综上,ASIP基因及重组ASIP蛋白对山羊脂肪细胞的脂肪沉积可能具有正向调控作用。本研究结果为进一步解析ASIP基因调控山羊脂肪沉积机制提供了重要理论基础。

内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2对血管新生的影响:生物信息学分析和实验验证

背景:血管新生是心血管疾病的主要干预靶点,骨形态发生蛋白2具有调控血管新生作用,但内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2对血管新生的调控作用不清楚。目的:探讨内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2对血管新生的影响。方法:(1)生物信息学分析:通过Panglao DB公共基因表达数据库单细胞转录组荟萃分析观察骨形态发生蛋白2细胞群表达丰度和定位。血管新生小鼠和内皮(心内膜)过表达骨形态发生蛋白2小鼠转录组测序数据集探索内皮细胞骨形态发生蛋白2对血管新生信号通路的调控作用。(2)体内实验验证:建立小鼠后肢缺血模型,对比模型小鼠患侧与健侧缺血后肢7,14和21 d血流灌注情况,免疫荧光和免疫组织化学染色评估小鼠骨形态发生蛋白2和CD31的表达定位情况。(3)体外实验验证:体外培养人脐静脉内皮细胞,分为对照组、缺氧组和骨形态发生蛋白2抑制剂(Noggin蛋白)干预组,培养24 h,观察各组内皮细胞血管新生情况。结果与结论:(1)内皮细胞是表达骨形态发生蛋白2的重要细胞亚群,在血管新生内皮细胞和骨形态发生蛋白2过表达内皮细胞转录组再分析均发现骨形态发生蛋白2表达明显升高,血管新生通路明显激活。(2)缺血7 d小鼠新生血管周围骨形态发生蛋白2阳性血管明显增加(P<0.05),缺血2周骨形态发生蛋白2阳性血管明显减少(P<0.001)。(3)体外培养人脐静脉内皮细胞,缺氧干预后,内皮细胞迁移能力和血管出芽明显增加,血管新生因子血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子的表达明显升高,Noggin明显减少了缺氧诱导的内皮细胞血管新生(P<0.001),并下调血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子的表达(P<0.01)。(4)结果证实,内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2具有调控血管新生作用,靶向性内皮细胞骨形态发生蛋白2可望改善血管新生。