特异切割DEN-2基因的核酶基因的合成与克隆

为探索有效的登革热治疗方法 ,根据DEN - 2基因结构的特点 ,按照锤头状核酶的结构模型和作用模式 ,设计、合成了针对 172～ 174GUC位点的核酶基因 ;其末端分别加上SacI和SalI接头 ,定向插入质粒pGEM - 3zf (+ )的SacI和SalI位点之间 ;其引导序列中的PvuII位点 ,提供了快速简便的核酶克隆的鉴定方法。PvuII酶切鉴定的核酶基因克隆经序列分析 ,结果与预期完全一致。证明得到了特异切割DEN - 2基因的核酶基因克隆 ,为进一步核酶抗DEN -

离子液体超声微波协同萃取金钗石斛总黄酮和石斛碱的研究

目的:应用离子液体超声微波协同萃取金钗石斛总黄酮和石斛碱。方法:研究不同离子液体、微波功率、提取时间及料液比对金钗石斛总黄酮和石斛碱提取得率的影响,在此基础上,利用响应面试验设计进一步优化。结果:最佳条件为:1.0 mol/L[Bmim]BF_4为萃取溶剂,微波功率328 W,提取时间185 s,料液比1∶22,测得金钗石斛总黄酮得率为0.490%,石斛碱得率为0.224%。与加热回流提取相比,金钗石斛总黄酮和石斛碱的得率均有所提高,提取时间从90 min缩短到185 s。结论:该提取技术能达到省时、高效的效果,可用于金钗石斛总黄酮和石斛碱的提取。

抗DEN-2基因核酶的克隆及其体外切割活性的研究

目的 探索核酶抗登革病毒活性。方法 根据DEN 2基因结构的特点 ,按照锤头状核酶的结构模型和作用模式 ,设计、合成针对 172～ 174GUC位点的核酶基因 ;定向插入质粒pGEM 3Zf(+)的SacⅠ和SalⅠ位点之间 ;核酶基因克隆和DEN 2靶基因克隆分别进行体外转录 ,生成核酶和靶RNA ,体外进行切割反应。结果 核酶与登革病毒靶序列体外产物电泳见预期切割条带。结论 该核酶具有切割相应靶RNA的活性 。

DEN-2分离株E基因部分序列原核蛋白表达

目的通过构建登革2型病毒(DEN-2)临床分离株(B株)E基因区1-476bp的原核表达载体,进行原核表达,为DEN-2E蛋白功能的研究提供基础依据。方法将DEN-2B株E基因区部分序列克隆入原核表达载体pET28a(+),命名为pET28a(+)-Eb;经酶切、PCR及测序鉴定后转化BL21(DE3)菌株,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白印迹(Western blot)鉴定表达蛋白;对表达蛋白进行纯化,并滴定对C6/36细胞的细胞半数致死量(TCID50)。结果成功构建了pET28a(+)-Eb原核表达重组质粒;SDS-PAGE分析表明,E基因区部分序列获得高效表达,其相对分子量约为23kDa,表达量约占菌体总蛋白的29%;Western blot表明,该目的蛋白可与DEN-2鼠单克隆抗体结合。用Ni柱亲和层析法纯化原核表达蛋白,纯度达90%。DEN-2B株E基因部分序列原核表达蛋白对C6/36细胞的TCID50为10-5.31。结论pET28a(+)-Eb可在BL21(DE3)菌株中高效表达;DEN-2B株E基因部分序列原核表达蛋白对C6/36细胞有明显的细胞毒作用。