树突表达特异性7跨膜蛋白促进甲状腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的机制

目的观察树突表达特异性7跨膜蛋白(DCSTAMP)对甲状腺乳头状癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响, 并探讨其机制。方法在基因表达谱交互式分析平台(GEPIA)中分析DCSTAMP在甲状腺乳头状癌组织中的表达;采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测甲状腺乳头状癌细胞系KTC-1、FTC-133及甲状腺正常细胞Nthy-ori 3-1中DCSTAMP表达的差异;在KTC-1和FTC-133细胞中分别转染过表达和敲低质粒及其对照, 构建DCSTAMP过表达和敲低细胞模型;过表达组通过细胞增殖/毒性检测试剂盒(CCK-8)、5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷(EdU)细胞增殖检测试剂盒检测DCSTAMP基因过表达后对增殖的影响;蛋白印迹法验证过表达后对细胞核增殖抗原(Ki-67)蛋白、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的影响;敲低组通过细胞划痕、侵袭测定实验(Transwell)实验检测DCSTAMP基因敲低后对迁移、侵袭的影响;蛋白印迹法验证敲低后对神经钙黏着蛋白(NCAD)、磷酸化蛋白激酶B蛋白(p-Akt)、总蛋白激酶B蛋白(t-Akt)表达的影响;两样本均数比较采用成组配对t检验分析。结果 RT-qPCR和Western blot结果均显示DCSTAMP基因在甲状腺乳头状癌细胞KTC-1、FTC-133中的表达高于甲状腺正常细胞Nthy-ori 3-1(RT-qPCR:DCSTAMP基因在Nthy-ori 3-1、KTC-1、FTC-133细胞中mRNA相对表达量分别为1.020±0.202、17.350±3.326、8.684±0.030, Nthy-ori 3-1与KTC-1比较:t=4.901, P<0.05;Nthy-ori 3-1与FTC-133比较:t=37.460, P<0.01;Western blot:DCSTAMP基因在Nthy-ori 3-1、KTC-1、FTC-133细胞中蛋白相对表达量分别为1.000±0.009、3.227±0.444、3.367±0.073, Nthy-ori 3-1与KTC-1比较:t=9.628, P<0.01;Nthy-ori 3-1与FTC-133比较:t=55.580, P<0.01);KTC-1、FTC-133细胞中DCSTAMP过表达组细胞增殖速度高于对照组(KTC-1对照组与过表达组第3天相对增殖速度:0.215±0.010:0.397±0.029, t=6.198, P<0.01;FTC-133对照组与过表达组第3天相对增殖速度:0.350±0.364:0.432±0.025, t=33.640, P<0.01), 过表达组增殖能力高于对照组[KTC-1对照组比过表达组:(8.382±1.400)%比(91.253±1.699)%, t=65.220, P<0.01;FTC-133对照组与过表达组:(14.385±2.441)%比(91.332±1.159)%, t=49.320, P<0.01], 过表达组Ki-67表达高于对照组(KTC-1对照组与过表达组蛋白相对表达量:1.000±0.038比1.282±0.134, t=9.968, P<0.01;FTC-133对照组与过表达组蛋白相对表达量:1.000±0.011比1.382±0.221, t=40.920, P<0.01), 过表达组MAPK表达高于对照组(KTC-1对照组与过表达组:1.000±0.012比1.088±0.057, t=10.720, P<0.01;FTC-133对照组与过表达组:1.000±0.039比1.220±0.123, t=9.404, P<0.01), 过表达组MAPK通路亚家族细胞外信号调节激酶(ERK)蛋白表达高于对照组:(1.000±0.005比7.047±0.088, t=68.650, P<0.01;FTC-133对照组与过表达组:1.000±0.003比1.983±0.029, t=34.000, P<0.01);而在KTC-1、FTC-133中敲低DCSTAMP基因后, 对照组细胞迁移速度高于敲低组(KTC-1对照组与敲低组:(72.545±0.704)%比(45.016±2.156)%, t=21.020, P<0.01;FTC-133对照组与敲低组:(82.422±0.196)%比(49.824±5.402)%, t=10.450, P<0.01), 对照组侵袭能力高于敲低组(KTC-1对照组与敲低组:(320.667±13.013)%比(172.333±11.240)%, t=14.940, P<0.01;FTC-133对照组与敲低组侵袭细胞数:302.667±24.111比228.000±14.422, t=4.603, P<0.01), p-Akt表达对照组高于敲低组(KTC-1对照组与敲低组:1.000±0.029比0.376±0.355, t=21.980, P<0.01;FTC-133对照组与敲低组:1.000±0.010比0.809±0.110, t=35.900, P<0.01)。结论 DCSTAMP基因通过激活MAPK通路亚家族ERK及Akt磷酸化在甲状腺乳头状癌细胞系中可以促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭。

骨关节炎患者外周血淋巴细胞基因表达谱的生物信息学分析

背景:目前没有监测骨关节炎发生或进展的敏感标志物,检测骨关节炎活动期外周血基因表达谱变化,有助于探寻血液中精确的诊疗靶点及阐释发病机制。目的:通过生物信息学方法分析骨关节炎患者与正常人外周血淋巴细胞基因表达谱差异,从分子层面探索血液中骨关节炎的诊疗靶点,为研究骨关节炎提供新思路。方法:从GEO和ArrayExpress数据库中查找骨关节炎血液相关的芯片数据,并下载GSE63359数据集。筛选样本包括46例骨关节炎患者血液和26例健康人血液,其中女性患者32例(健康女性19例)。用R语言limma包分别筛选出男/女性骨关节炎和男/女性健康人之间的差异表达基因,用ggplot2包绘制火山图,ComplexHeatmap包绘制热图。设定阈值为P<0.05&|log2FC|>0.5获取差异表达基因,然后制作韦恩图,得到8个差异表达基因:MAP2K7、CREBZF、CLK4、TRIM37、IL18RAP、LRRN3、BLNK和MS4A1;通过DAVID对差异表达基因进行GO和KEGG通路分析,并用R语言ggplot2包绘制气泡图。用STRING和Cytoscape软件构件PPI网络,Mcode和centiscape插件进行模块分析,Cytohubba筛选出关键基因。结果与结论:共筛选出差异表达基因115个,其中上调基因16个,下调基因99个,对所有差异表达基因进行GO富集分析主要集中在“淋巴细胞介导的免疫”“体液免疫反应”“抗原受体介导的信号通路”“B细胞受体信号通路”“免疫球蛋白介导的免疫反应”和“吞噬作用的正调控”等生物功能上;KEGG主要富集在5条与骨关节炎相关的通路上:造血细胞谱系、Th1和Th2细胞分化、Th17细胞分化、破骨细胞分化和TNF信号通路。利用PPI网络及相关插件筛选出10个与骨关节炎高度相关的关键基因,其中瘤坏死因子、CD19、转铁蛋白受体、配对框5、丝裂原活化蛋白激酶7、CD24、CD20和B细胞连接器8个核心基因与骨关节炎炎症和细胞凋亡高度相关。提示:通过生物信息学分析发现骨关节炎和健康人的外周血淋巴细胞基因表达差异集中在炎症反应和细胞凋亡,从而使血液表达谱成为监测骨关节炎靶点标记物和研究其潜在分子机制的有效突破口。

树突状细胞-特异性跨膜蛋白在甲状腺乳头状癌组织的表达及其临床意义

目的探讨甲状腺乳头状癌中树突状细胞-特异性跨膜蛋白(DC-STAMP)的表达及其临床意义。方法收集郑州大学第一附属医院54例甲状腺乳头状癌患者手术新鲜癌组织及正常甲状腺组织,应用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测甲状腺乳头状癌组织及配对正常甲状腺组织中DC-STAMP mRNA和蛋白的表达,应用免疫组织化学技术检测甲状腺乳头状癌组织芯片中DC-STAMP蛋白、鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(BRAF)蛋白和BRAF V600E突变蛋白的表达水平,采用t检验分析甲状腺乳头状癌组织和正常甲状腺组织DC-STAMP表达量差异,采用χ^(2)检验分析DC-STAMP mRNA表达水平与甲状腺癌患者临床病理学特征的相关性,采用χ^(2)检验分析DC-STAMP与BRAF V600E突变的相关性。结果 DC-STAMP mRNA在甲状腺乳头状癌组织相对表达量显著高于正常甲状腺组织[升高(3.354±2.938)倍,t=5.886,P<0.05],其表达水平与肿瘤多灶性明显相关(χ^(2)=4.396,P<0.05)。DC-STAMP蛋白在甲状腺乳头状癌组织相对表达量明显高于正常甲状腺组织。DC-STAMP在甲状腺乳头状癌中的表达与BRAF V600E突变明显相关(χ^(2)=3.962,P<0.05)。结论 DC-STAMP在甲状腺乳头状癌组织中明显过表达且表达水平与肿瘤多灶性明显相关。DC-STAMP与BRAF V600E突变明显相关,在甲状腺乳头状癌的侵袭和转移中可能起重要作用。

人DC-SIGN基因表达质粒的构建及其表达

目的构建含有人DC-SIGN基因的真核表达载体,并在293T细胞中表达目的蛋白。方法人血培养获得树突状细胞(DC),以DC的mRNA逆转录cDNA为模板,应用PCR体外扩增获得目的 DNA,用限制性内切酶SalⅠ和BamHⅠ分别酶切VRC4409载体和PCR产物,通过连接、转化及克隆的筛选将目的基因克隆入载体VRC4409,构建载体VRC4409-DC-SIGN,经PCR鉴定及测序分析证实,脂质体介导转染293T细胞,蛋白质印迹分析其表达DC-SIGN蛋白。结果重组质粒经双酶切和测序鉴定证实VRC4409-DC-SIGN构建成功,DC-SIGN蛋白在293T细胞中成功表达。结论成功构建质粒VRC4409-DC-SIGN并在293T细胞中表达目的蛋白,为进一步研究DC-SIGN的生物学功能奠定了基础。

人DC—SIGN基因表达质粒的构建及其表达

目的构建含有人DC—SIGN基因的真核表达载体，并在293T细胞中表达目的蛋白。方法人血培养获得树突状细胞（Dc），以DC的mRNA逆转录cDNA为模板，应用PCR体外扩增获得目的DNA，用限制性内切酶Sal I和BamH1分别酶切VRC4409载体和PCR产物，通过连接、转化及克隆的筛选将目的基因克隆人载体VRC4409，构建载体VRC4409-DC—SIGN，经PCR鉴定及测序分析证实，脂质体介导转染293T细胞，蛋白质印迹分析其表达DC—SIGN蛋白。结果重组质粒经双酶切和测序鉴定证实VRC4409-DC—SIGN构建成功，DC-SIGN蛋白在293T细胞中成功表达。结论成功构建质粒VRC4409-DC—SIGN并在293T细胞中表达目的蛋白，为进一步研究DC—SIGN的生物学功能奠定了基础。